Summary
このプロトコルの目的は、心臓の酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル システムとしてマウス新生児心筋細胞を使用する方法を説明するためにです。
Abstract
ミトコンドリアおよび酸化的代謝心臓筋肉の機能を維持するために重要です。研究は、心不全、心臓機能障害の重要な要因のミトコンドリアの機能低下を示しています。対照的に、不良ミトコンドリア機能を復元すると、失敗した心における心機能の改善に有益な効果があります。したがって、調節のメカニズムを勉強して、ミトコンドリア機能の新しい調節の識別は、心臓病の治療のための新しい治療上のターゲットを開発するために使用可能性があります洞察力を提供できます。ここでは、ユニークな細胞培養系を用いた心筋細胞のミトコンドリア呼吸を分析します。まず、プロトコルは急速に分離し、高生存率新生児マウス心筋細胞の培養に最適化されています。その後、96-well 細胞フラックス アナライザーを使用してこれらの心筋の酸素消費量を評価します。このプロトコルの播種条件を最適化し、示した細胞フラックス アナライザーでその新生児マウス心筋酸素消費量を簡単に評価できます。最後に、我々 は大きく文化に私達のプロトコルを適用できるし、他の研究は、細胞内シグナル伝達などと収縮機能解析を注意してください。
Introduction
連続的な心臓の収縮機能を維持するために、心筋細胞は ATP1の形で主に細胞のエネルギーの安定供給を維持しなければなりません。中心部には、ATP の約 95% はミトコンドリア酸化的リン酸化、ミトコンドリアが心機能2,3で重要な生体エネルギーの役割を再生表示を中心にによって生成されます。この概念を支えるは、ミトコンドリア機能の不全心筋症や心不全の4,5につながることができます。逆に、失敗の心機能を改善するために示されているミトコンドリアの機能を復元する6、7の心します。したがって、ミトコンドリアのエネルギー代謝のメカニズムを勉強して、心筋細胞のミトコンドリア機能の新しい調節を識別する心臓エネルギーの生産の機械論的な洞察力を明らかにはしない、またつながる洞察力を提供できます。心疾患6,8の治療に新しい治療上のターゲットの開発。
心臓全体と比較して、非常に純粋な非筋細胞線維芽細胞や血管内皮細胞10など、心の底からの雑菌は心筋細胞と非筋細胞9、心筋細胞文化の混合物が含まれています。さらに、新生児の子犬から心筋細胞を分離する大人の心10,11から分離する細胞と比較して時間の少量の細胞の数が多いを養殖できます。最も重要なは、一次培養アダルト マウス心筋細胞 (例えば 24 h) 回生存期間が短縮、長い時間でポイントが逆差別化します。新生児マウス心筋細胞は生き残ることができる、7 日間の培養、心筋細胞10薬剤化合物とミトコンドリアの機能に関する遺伝子操作の効果をテストに最適な上向きの操作します。もちろん、成人と新生児の細胞の重要な生物的違いがあるが、新生児の細胞の培養のため長い期間使用可能なため、ミトコンドリア機能のそれらを含む研究の多くの異なる種類の適切です。
までに、一次培養新生児マウスおよびラットの心筋細胞は、心臓の生体エネルギー12,13を研究するモデルとして使用されています。近年では、研究は酸素消費量 (OCR) を測定し、マウスおよびラット新生児心筋細胞14,15酸化能力を評価する細胞フラックス アナライザーを使用しました。一方、ラットと比較して、マウス新生児心筋細胞の細胞生存率が低い、大きい変動16です。また、遺伝子改変マウスのモデルから細胞を調査する機能はマウス細胞モデルを非常に重要ななります。OCR 研究が細胞数および播種密度に敏感、一貫性のある細胞収量および生存率を達成するために再現性のある、信頼性の高い、簡単なプロトコルの開発が必要です。
ここでは、OCR 解析 96 ウェル フォーマット細胞フラックス アナライザーと共に培養マウス新生児心筋細胞を使用して開発されている最適化されたプロトコルを報告します。このプロトコルは、アッセイの再現性を大きく向上します。また、プロトコルだけでなく小説や OCR 分析の再現性のある方法を提供がも、筋原繊維機能を研究するために必要と細胞内となるよう、他の実験目的のためはより大きいサイズの文化に適応することができます。シグナル伝達経路。
特に、このプロトコルは 96-well 細胞培養プレート新生仔マウスにおける心筋細胞の分離と培養の 1 日プロシージャを記述します。さらに、それは細胞外フラックス アナライザーを使用して酸素消費量を測定する手順を説明します。使用されるすべてのソリューションが滅菌、滅菌フィルタ リングします。すべてのツールは、75% エタノールで滅菌されています。プロシージャのさまざまな部分の材料のテーブルを提供します。心筋細胞を培養するためすべての手続きや手順は、標準セル文化フードで実行されます。このプロトコルは、1 リットル (約 8-10 子犬) から新生児マウス心を分離するため開発されています。ただし、プロトコルは、複数の仔から心筋細胞を分離するために適応させることができます。
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Protocol
新生仔マウスの仕事のためなど動物プログラムによってローカル大学のガイドラインのセットを参照してくださいして 1 つの機関およびその他適切な法律を遵守ください。このプロトコルで記述されているすべてのメソッドは UC サンディエゴ機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されているし、連邦および州の規制に準拠します。
1. 試薬の調製
- 事前消化液25 mL を準備: トリプシン (0.5 mg/mL) を添加した Ca2 +と Mg2 +) を除いた HBSS。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションを殺菌し、使用するまで氷の上を保ちます。実験の日は、事前消化ソリューション。
注:Ca2 +なし HBSS を使用することが重要と Mg2 +Ca2 +と Mg2 +は、心筋収縮と分離の間にそれに続く細胞死。 - 30 mL のコラゲナーゼ消化バッファーを準備: コラゲナーゼ (0.8 mg/mL、約 350 U/mL) (Ca2 +と Mg2 +) なし HBSS バッファーに溶解しました。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションを殺菌し、使用するまで氷の上を保ちます。実験の日は、コラゲナーゼ消化ソリューション。
- 心筋細胞培養媒体 (成長媒体)の 500 mL を準備: DMEM の 375 mL、M-199 の 125 mL、25 mL のウマ血清の FBS の 12.5 mL をミックスします。1% ペニシリンとストレプトマイシン溶液を補足します。
- ミトコンドリア ストレス テスト メディアの準備: DMEM を作る 200 mL ベース 1 mM ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン, 2 mM と 10 mM グルコース 2 mM Hepes と補われる (DMEM NaHCO3、なし参照テーブルの材料) ストレス テスト中。
注:ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、ブドウ糖、Hepes、ファイラー、滅菌せず DMEM 培地 1 L を作るし、4 ° C で保存アッセイの日にストレス テスト媒体を準備するには、その他の試薬を追加します。DMEM を使用せず NaHCO3媒体は重要です。 - 使用の日の 7.4 にミトコンドリア ストレス テスト メディアの pH を調整します。使用前に 37 ° c の暖かいメディア。
- オリゴマイシンの準備: DMSO で 5 mM 原液 5 mL を準備、250 μ 因数を作る、-20 ° C で保存
- FCCPの準備: DMSO で 5 mM 原液 5 mL を準備、250 μ 因数を作る、-20 ° C で保存
- アンチマイシン Aの準備: DMSO で 5 mM 原液 5 mL を準備、250 μ 因数を作る、-20 ° C で保存
- ロテノンを準備: DMSO で 5 mM 原液 5 mL を準備、250 μ 因数を作る、-20 ° C で保存
注:すべての試薬およびソリューションをこのプロトコルで使用される表1 のとおりです。
2. 収穫と新生児マウス (1 日目) から心の事前消化
- オートクレーブ ハサミ、鉗子、モリア スプーンを消毒します。
- 無菌細胞文化フードのすべての手順を実行します。
- (せずに Ca2 +Mg2 +) HBSS の 6 も細胞培養プレートの各ウェルに分注 5 mL氷の上を配置します。分注 10 mL HBSS の 10 cm 細胞培養ディッシュに。
- 50 mL の生殖不能の円錐管のトリプシン事前消化液 20 mL を準備します。氷の上のすべてのソリューションをしてください。
- すぐに殺菌のため 70% エタノール溶液で新生児 (0 日) マウスを浸しなさい。
- 麻酔なしで、(まっすぐ) 滅菌はさみを使用して子犬の首をはねるし、胸部キャビティおよび中心へのアクセスを許可するように胸骨に沿って胸を開きます。(図 1 a)
注: 1) P0 新生児マウスを高細胞生存率を達成するために使用することが重要です。2) この安楽死方法は NIH とアメリカの獣医の医学連合のガイドライン17に従って新生児許可します。 - 高級はさみ (せずに Ca2 +Mg2 +) HBSS を含む無菌細胞培養皿はすぐに転送と体から心を抽出 (図 1 b)。
- 残存肺組織、大型船舶等を削除 (と心房、必要な場合)。利用した穏やかな攪拌 HBSS ソリューションで心を洗います。
- 高級ハサミで 8 個にそれぞれの心をカットし、HBSS (図 1 と 1 D) と 6 も細胞培養プレートの 1 つのウェルに鉗子ですべての心臓組織を転送します。
- HBSS、モリアのスプーン (図 1) を使用して満ちて 6 ウェル プレートで井戸から井戸に心を移すことによって心を洗います。
注:転送心よくからよく血を洗うのに十分です。血液酵素消化を妨げますので、HBSS で心の中を洗浄し、血液を除去することが重要です。 - 20 mL のトリプシン (0.5 mg/mL) を含む円錐管にモリアのスプーンで心を移すし、4 h (図 1E) の 4 ° C で穏やかな攪拌と孵化します。
3. 準備 96 ウェル培養プレート (1 日目)
- コーティング溶液 5 mL を準備: 0.5% のゼラチン (使用する前にオートクレーブ) と 1% フィブロネクチン溶液を含む PBS。(例えば 5 mL ゼラチン溶液とフィブロネクチン溶液 50 μ L)
- 96 ウェルの細胞培養プレートの各ウェルにコーティング溶液 50 μ L 分注 (材料の表を参照してください)。気泡が存在する場合を泡を吸う 20 μ L ピペットを使用してそれらを削除します。
注:コーティング液の各ウェルの表面すべての領域をカバーすることが重要です。 - マトリックス コーティングの乾燥を許可する 1 h 以上の 37 ° C 細胞文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。
- 心筋細胞を播種する前に任意の残留塗液を吸い出しなさい。
4. 酵素消化、細胞 (1 日目) のめっき
- 37 ° C の水浴中のコラゲナーゼ消化ソリューションは事前に暖かい。
注:これは、手順は効率的な酵素の消化力を達成するために重要です。 - 心と細胞文化フードに 4 ° C から事前消化ソリューションを含む円錐管を移動します。(図 1 f)
- 心管の底に沈むと 10 mL の血清ピペットを使用して事前消化ソリューションを削除 (分離培地の 1 ~ 2 mL チューブに残る場合があります)。
- HBSS 管に 10 mL を追加します。再の中断心 HBSS を 2-3 回 10 mL の血清ピペットを使用してトリプシンを洗浄します。HBSS を吸引 (1 ~ 2 mL チューブに残る場合があります)。
- 心としたチューブに予め温めておいたコラゲナーゼ消化溶液 10 mL を追加します。(図 1)
- 心撹拌せず 10 分の 37 ° C の水浴中でチューブを孵化させなさい (1 日消化)。
- 第 1 消化後細胞文化フードにチューブを移動します。ゆっくりゆっくり 10 回 10 mL の血清ピペットを使用してチューブ内の心を再停止することによって心をカップ刻んだ。これは、分散する心と心臓組織から放出される細胞が許可されます。(図 1 H)
注:心筋細胞がもろくなっているので穏やかな製粉は高い生存率を達成するために重要です。 - シンク、心筋 (約 9-10 mL) 新しい円錐管に濃縮消化ソリューションを転送およびコラゲナーゼの消化力を停止する細胞培養媒体の等しい量を追加すぐに未消化の組織ができます。
- 残りの未消化の心臓組織を含むチューブにコラゲナーゼ消化溶液 10 mL を追加します。
- 10 分の 37 ° C の水浴の心臓組織と管を孵化させなさい (第 2 消化)。
- 4.7 ・ 4.8 の手順を繰り返します。
注:まだまだ未消化の組織がある場合は、消化 1 つより多くの時間を繰り返します。しかし、ほとんどのケースで 2 つ消化力は心臓組織から細胞の大部分を分散するのに十分です。 - 新しい滅菌 50 mL のコニカル チューブに無菌細胞ストレーナー (100 μ m ナイロン メッシュ) を配置します。中古ウェットは 2-3 ml の細胞培養媒体のセル ストレーナーとセル ストレーナーを介して細胞を通過します。2-3 ml の細胞培養媒体のセル ストレーナーをすすいでください。(図 1I)
- (図 1 j) 180 x gで 5 分間心筋細胞を含む円錐管を遠心します。細胞組織の残骸が含まれてし、10 ml の細胞培養媒体 (図 1 L) 細胞ペレットを再中断上清 (図 1 K) を吸引します。
- 優しく細胞と 10 cm の細胞培養ディッシュ (プラスチック コーティングの任意の種類なし) に板細胞を再懸濁します、携帯文化のインキュベーター (1 プレめっき) で 1 時間インキュベート (図 1 M)。このプレめっきステップにより、非心筋細胞、線維芽細胞と血管内皮細胞、コーティングされていない細胞培養シャーレに付着するなどです。
注:この時点では、心筋細胞は丸い形は、通常、顕微鏡下で光沢のある表示。(図 1 n)。 - 1 時間培養した後に、優しくプレートを扇動、10 cm の培養皿から非付着細胞 (心筋細胞の濃縮) を洗浄し、再細胞培養液を 10 mL の血清ピペットを使用して料理を繰り返しピペッティングにより細胞を中断します。新しい 10 cm 細胞培養ディッシュ (プラスチック、コーティングなし) に非付着細胞 (心筋細胞の濃縮) を転送し、携帯文化のインキュベーター (2 プレめっき) でさらに 1 時間インキュベートします。
注:非コーティング プレートに細胞が支配的非心筋細胞: 線維芽細胞と血管内皮細胞、(図 1O) 顕微鏡の下で視覚化できます。 - 第 2 回プレめっき後に、ゆっくりプレートを扇動、10 cm の培養皿から非付着細胞 (心筋細胞) を洗って、新しい 50 mL の円錐管に心筋細胞を移します。
5. 96 ウェルの細胞培養プレート (1 日目) にセルとめっきセルをカウントします。
- 診断を使用してセルをカウントします。
- 200 μ L (図 1 P) の最終巻でマルチ チャンネル ピペットを使用して 10 の3細胞/ウェル x 10-30 の間密度の細胞外マトリックス コート 96 ウェルの細胞培養プレートに細胞をプレートします。背景の井戸 A1、A12、H1、H12 を使用: これらの井戸 (セルの) で他の井戸として培養液 200 μ L を追加。37 ° C 細胞文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。
注:本研究では、酸素消費量は 10 x 10320 × 10 の3、または 30 x 103細胞/ウェルなどの異なるセル密度を使用してによってテストされました。(図 2 a)。また、上記のように、分離の直後に心筋は丸い形は、通常、顕微鏡下で光沢のある表示。16-24 時間文化の内で実行可能なセルが平らになります。
6 96 ウェル フォーマット細胞フラックス アナライザー (日 2) を使用して酸素消費量測定
注:酸素消費量試金はセルをめっき後 1 日実施またはそれ以降。このプロトコルは、7 日間を生き残ることができる新生児心筋細胞培養を用いた分離をポストします。
- フラックス アナライザー センサー カートリッジを水和物 (材料の表を参照してください)、少なくとも 3 時間、しかし、理想的に試金の前に、丸一日のため。Calibrant 溶液 200 μ L を追加ユーティリティ プレートのウェルにユーティリティのプレートの上にバック センサー カートリッジを置くし、CO2や O2補充なし 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい (材料の表を参照してください)。
- 細胞培養媒体 [ミトコンドリア ストレス テスト中] に変更すると、アッセイの前に 1 時間。心筋細胞が壊れやすいです。したがって、慎重にマルチ チャンネル ピペットを使用して細胞の培養基を削除、予め温めておいたミトコンドリア ストレス テスト メディアの 200 μ L でセルを洗浄して 2 回。第 2 洗浄後に予め温めておいたミトコンドリア ストレス テスト メディアの 175 μ l 添加し CO2や O2補充なし 37 ° C の定温器の細胞の培養します。
- 集中テスト混合物を準備します。ミトコンドリア ストレス テストの 16 μ M のオリゴマイシン、FCCP、9 μ M、20 μ M ロテノンと 20 μ M アンチマイシン A、すべてミトコンドリア ストレス テスト中の混合物の各 3.0 mL を準備します。
注:記載されている濃度各化合物をテストされています。しかし、自分の研究室の各化合物の濃度を滴定は必要です。 - マルチ チャンネル ピペット (図第 1 四半期) を使用してセンサー カートリッジのインジェクターのポートに各化合物の 25 μ L をロードします。ボリュームと最終的な濃度は表 2のとおりです。
- 細胞外のフラックスの試金のプロトコルを設定します。プログラムに記載されてテーブル 3.
- プログラムを起動します。まず、校正 (図 1 r) 機にセンサー カートリッジを入れます。校正手順が完了したらは、アッセイ プレートの calibrant を交換します。
注:製造元から提供されたソフトウェアを使用して、ポートと井戸と各化合物のグループを示します。 - 必要に応じて、アッセイ後、慎重にマルチ チャンネル ピペットを使用して、すべてのアッセイ中を破棄し、蛋白質の試金を使用して未来のセル正規化の-20 ° C で細胞培養プレートを格納します。
- タンパク質含有量を測定します。標準リッパ細胞溶解液を 50 μ l 添加 (材料の表を参照してください)。完全に細胞を溶解する 30 分間氷の上プレートを孵化させなさい。すべての材料を新しい明確なフラットボトム 96 よくアッセイ プレートに転送します。
- 製造元のプロトコルに従って BCA アッセイによってタンパク質の濃度を測定します。
注:各ウェルの高蛋白質の集中の結果細胞外マトリックスで井戸をコーティングします。したがって、実際のセルの蛋白質の集中を取得するバック グラウンド well(s) (電池なし) の量を減算します。細胞由来タンパク質濃度は低い 96 ウェル培養プレートです。さらに、タンパク質濃度は、細胞外マトリックス コーティングにより井戸-井戸から変更できます。そのため、OCR を正常化するセル番号を使用することをお勧めします。
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Representative Results
説明されたプロトコルを使用して、心は 0 日目の新生児の子犬から分離されました。5 x 10 の5セル/子犬を入手し、心筋細胞が 10 x 10320 × 10 の3、または 30 x 103細胞/ウェル、96 ウェル プレート (図 2 a) の密度で播種しました。一晩培養後心筋細胞が発見されたコーティング プラスチック表面によく付着 (未接続の細胞としてラウンドと広がるである健康、接続されている細胞と比較して、光沢があるが表示されることはまだ) 非常に少数の接続されていない細胞があった (図 2AB)。この時点で、自発的に引き締まる心筋細胞は簡単に表示されていた。30 x 103細胞/ウェル播種密度はセルが広がる播種後 1 日合流点を示した。ラウンド (死んだ) 細胞の数が非常に低い、これらの結果は、プロトコルは心筋細胞の高い細胞生存率を与えることを示した。心筋細胞は、サルコメア α-アクチニン、この声明の証拠として心筋細胞特異的マーカー18に対する抗体と immunostained だった。図 2に示すように、心筋細胞分離の高純度を示す α-アクチニンの染色陽性細胞のほとんどを示した。
典型的なミトコンドリア ストレス テストの 1 つのスキームを図 3に示します。ミトコンドリアのストレス テストは、酸素消費量 (OCR) のベースラインの測定から始まります。オリゴマイシン atpase 活性を抑制する注射が続きます。オリゴマイシン注入ショー、OCR の前後の違いは、ATP の生産にリンク。その後、FCCP の連結を解くことのエージェントは、最大酸素消費量を測定するため注入しました。予備の呼吸容量は基底の違いとして計算できます、最大 OCR。最後に、電子輸送の 2 つの複雑な阻害 (アンチマイシン A とロテノン) の射出とミトコンドリアの呼吸が完全に停止、および OCR は、その最も低いレベルに減少します。このレベルで、ミトコンドリアの活性をブロックすることによって酸素消費量は非ミトコンドリアです。基底の呼吸、プロトンの漏れ、そして最大呼吸を非ミトコンドリア呼吸 (アンチマイシン A とロテノン存在下で OCR) とベースラインの測定、オリゴマイシンの存在下で OCR と OCR での違いとして計算できます、FCCP の存在それぞれ。
本研究では 1 日のセル隔離後 96-well 細胞フラックス アナライザー システムを使用して OCR 分析を行った。さらに、OCR、アッセイ前、3 時間以内に血清飢餓の効果をテストするための細胞培養媒体は通常細胞培養の成長媒体血清、有無は血清に変更されました。実行後 OCR 測定データ 1 ごとの 12 までに輸出された記録およびそれ以上の分析のためのスプレッドシート。代謝特性は次のとおりだった。
非ミトコンドリア呼吸 = 平均 OCR (10, 11, 12)
基底呼吸 = 平均 OCR (1, 2, 3)-平均 OCR (10, 11, 12)
ATP の生産 = OCR (1、2、3) を平均-OCR (4, 5, 6) の平均
プロトン リーク = 平均 OCR (4, 5, 6) - 平均 OCR (10, 11, 12)
最大呼吸 = 平均 OCR (7、8、9) - 平均 OCR (10, 11, 12)
図 4 aに示すように、OCR 値を簡単に解析していた、注入剤の効果も明らかにされました。重要なは、バリエーション標準誤差で示すように、井戸に井戸からは小さかった。細胞の増加増加のベースラインの測定、オリゴマイシン、FCCP 治療呼吸で起因した数。血清飢餓細胞と比較して、OCR は、成長媒体で培養されていた分析のセルに高いでした。図 4 bに示すように、OCR は、基底の呼吸で表示されます陽子リーク (オリゴ) と 1 x 10 の4セルあたり最大呼吸 (FCCP)。10 x 10 の3セルごと OCR は, 播種密度が 20 K と 30 K の細胞/ウェル 10 K 細胞/ウェルのそれより高かった。図 4で示すとおり、相対的な OCR のプロトン リーク (オリゴ) と最大 (FCCP) 成長のメディアと血清との間と同様の値が表示基底呼吸に対する OCR を表現することによってグループが餓死しました。播種密度では相対的なプロトン リークと最大の酸化能力が影響しないことが示唆されました。
全体的にみて、このプロトコルを使用して、マウス新生児心筋細胞の優れた収率が正常に隔離され、培養します。OCR は、細胞外のフラックス アナライザーでこれらの細胞を使用して評価できます。また, 播種密度が大幅与えないこと OCR セル数によって計算されます。ただし、短期的 (3 h) 血清飢餓は、OCR を減少します。情報は種々 の実験条件でマウス新生児心筋細胞 OCR のテストに役立ちます。
図 1: 0 日新生児マウスから新生児心筋細胞の分離と培養。(A) 新生児が安楽死させたし、胸部から心臓を解剖。(B) 心は (せずに Ca2 +Mg2 +) HBSS で洗っています。(C) それぞれの心は、8 個にカットされます。(D) 心は HBSS でいっぱい 6 ウェル プレートに移動されます。心は、井戸に井戸から転送モリアのスプーンを使用して洗っています。(E) 心が穏やかな攪拌と 4 ° C でトリプシン HBSS で事前消化です。(F) Predigested 心臓組織 4 ° C で 4 時間培養後(G) ハート 10 分コラゲナーゼの消化力の後の組織。(H) コラゲナーゼ消化組織、練和の心です。(私) 分離された心筋細胞を細胞ストレーナー濾過。(J) 心筋細胞ペレットなの遠心分離によって。(K) コラゲナーゼと培地は、吸引によって削除されます。(L) 心筋細胞が新鮮な培地の再懸濁です。プレめっき用 10 cm プラスチック皿に (M) 心筋細胞を培養しています。A (N) プレめっきの 1 h 後 (ラウンドと光沢のある細胞) 心筋細胞の代表的なイメージ。(O) プレめっきとし、非付着性心筋細胞、線維芽細胞では通常細胞と血管内皮細胞の残りの除去が表示されます後。(P) 96 ウェル プレートに心筋細胞をメッキします。(Q) センサー カートリッジの注入ポートに試薬を読み込みます。(R) 細胞外フラックス アナライザー マシンにパット センサー カートリッジ。スケール バー = 0.1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 細胞外フラックス アナライザー 96 ウェル プレート上における心筋細胞の培養します。(A) 心筋細胞 (上段) を播種または 18 h ポスト シード (下段) の直後に、対応するセル密度の 96 ウェル プレートでの代表的なイメージ。(B) A 10 x 103細胞/ウェルの細胞密度で播種心筋細胞 18 h 記事の高倍率画像。(C) 心筋細胞は (青) 反サルコメアの α-アクチニン抗体 (緑) と (核染色) として DAPI 染色された.スケール バー = 0.1 mm。免疫染色に使用される方法は、当社の以前の文書18で見つけることが。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。ミトコンドリア ストレス テストの模式図。基底、ATP リンク、最大、および非ミトコンドリア呼吸呼吸の予備容量、プロトン リークを含む生物エネルギーのパラメーターと対応するミトコンドリア エフェクター トレースに記載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ミトコンドリア ストレス アッセイ。(A) 新生仔マウス心筋の酸素消費量 (OCR、pMoles/分) の代表的なトレース。示された時間、オリゴマイシン (オリゴ、1 μ M)、FCCP (800 nM)、RAA (ロテノンとアンチマイシン A、各 1 μ M) を注入したと。各測定ポイントの平均と 10 の個々 の井戸の意味 (SEM) の標準誤差が表示されます。(B) OCR は、10 x 103セルごとにオリゴ (プロトン リーク)、FCCP (最大呼吸) 基底の呼吸として計算されます。(C) OCR は、基底の呼吸を基準にして表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 試薬とソリューションの名前 | 準備 | ノート |
| トリプシン事前消化ソリューション | (なしで ca 2 + と mg 2 +) HBSS でトリプシンを溶解します。最終濃度は、0.5 mg/mL です。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションを殺菌し、使用するまで氷の上を保ちます。 | 実験の日は、事前消化ソリューション。 |
| コラゲナーゼ消化ソリューション | (なしで ca 2 + と mg 2 +) HBSS でトリプシンを溶解します。最終濃度は、0.5 mg/mL です。0.22 μ m のフィルターを使用して、ソリューションを殺菌し、使用するまで氷の上を保ちます。 | 実験の日は、コラゲナーゼ消化ソリューション。 |
| 心筋細胞培養媒体 | DMEM の 375 mL、M-199 の 125 mL、25 mL のウマ血清の FBS の 12.5 mL を混ぜます。1% ペニシリンとストレプトマイシン溶液を補足します。 | 心筋細胞培養媒体実験前に行うことができます、4 ° C で 1 ヶ月保存します。 |
| ミトコンドリア ストレス テスト中 | まず、作る 1 L DMEMなしで媒体の任意ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、ブドウ糖、Hepes、滅菌処理するフィルターし、4 ° C で保存試験の日、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、ブドウ糖、Hepes を追加します。使用する前に 7.4 に pH を合わせなさい (滅菌が必要ではありません)。 | 以下のサプリメントを最終濃度: ピルビン酸ナトリウム (1 mM)、L-グルタミン (2 mM)、グルコース (10 mM)、Hepes (2 mM) |
| オリゴマイシン株式 | DMSO のオリゴマイシンを溶解します。最初、原液 5 mL を準備します。オリゴマイシン DMSO 溶解、250 μ L の因数を作る、-20 ° C で保存 | アッセイの日を使用する 1 つの因数を取る。多くの凍結融解は避けてください。 |
| FCCP 株式 | FCCP DMSO で溶解します。最初、原液 5 mL を準備します。最終濃度は 5 mM です。FCCP DMSO 溶解、250 μ L の因数を作る、-20 ° C で保存 | アッセイの日を使用する 1 つの因数を取る。多くの凍結融解は避けてください。 |
| アンチマイシン A 株式 | アンチマイシン A DMSO で溶解します。最初、原液 5 mL を準備します。最終濃度は 5 mM です。アンチマイシン A を完全にあり、DMSO に溶解するため 250 μ 因数に、-20 ° C で保存します。 | アッセイの日を使用する 1 つの因数を取る。多くの凍結融解は避けてください。 |
| ロテノン株式 | ロテノン DMSO で溶解します。最初、原液 5 mL を準備します。最終濃度は 5 mM です。ロテノンは完全に DMSO に溶解し、250 μ L の因数を作る、-20 ° C で保存 | アッセイの日を使用する 1 つの因数を取る。多くの凍結融解は避けてください。 |
| 細胞培養プレート コーティング液 | まず、0.5% ゼラチン溶液 200 mL を作る。PBS およびオートクレーブでゼラチンを溶かします。実験の日、コーティング液を 5 mL ゼラチン溶液にフィブロネクチン溶液 50 μ L を追加します。 | 0.5% ゼラチン液は、2 ヶ月間常温保存できます。 |
表 1: 試薬および解決。
| 射出ポート | 化合物と濃度 | ボリューム (μ l) の実行中に注入 | アッセイの最終濃度 |
| A | 16 μ M のオリゴマイシン | 25 | 2 Μ M |
| B | 9 Μ M FCCP | 25 | 1 Μ M |
| C | 20 μ M ロテノン (Rot) 20 μ M アンチマイシン A (AA) |
25 | それぞれの 2 μ M |
表 2: 注射薬混合調製。
| 手順と手続き | 測定とループ |
| 校正 | - |
| 平衡 | - |
| ベースラインの測定 | 3 回: ミックス 3 分、2 分待って、3 分を測定 |
| 注入ポート (オリゴマイシン) | - |
| 測定 | 3 回: ミックス 3 分、2 分待って、3 分を測定 |
| ポート B (FCCP) を注入します。 | - |
| 測定 | 3 回: ミックス 3 分、2 分待って、3 分を測定 |
| ポート C (RAA) を注入します。 | - |
| 測定 | 3 回: ミックス 3 分、2 分待って、3 分を測定 |
表 3: 細胞外フラックス アナライザー プログラム。
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Discussion
本研究では、分離すること、マウス新生児心筋細胞を培養するための単純なプロトコルを設けています。これらの心筋細胞を用いて、細胞フラックス アナライザー システムを用いた酸素消費量を測定するための条件も最適化されています。プロトコルでは、そのままの臓器で測定されるものに似ている、心の主作業セルの酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル システムとしてマウス新生児心筋細胞を使用することができます。我々 のプロトコルは、以前に公開されたプロトコル16,18によって違います。まず、高い生存率を達成するために出生時すぐに唯一の子犬、他プロトコル16,19で一般的に使用されている (P3 に P0 子犬) 時代の三日に日ゼロからものではなく (すなわち P0) を使用します。第二に、実験の時間を最小限に抑えるために心だけ中古で消化された 4 時間トリプシン。さらに、単純なプロシージャをする、再現可能な結果を達成するために従って最小限の手順を採用しました。たとえば、我々 のプロトコルは HBSS の PBS バッファーの 2 種類のみとの細胞培養媒体の 1 種類のみを使用して、コラゲナーゼの消化力の間の撹拌を採用していません。
OCR 試験の再現性のために重要である新生児マウス心筋細胞の生存を達成するためにいくつかの重要なポイントがあります。まず、P0 新生の子犬を使用して、同じ日にトリプシン事前消化およびコラゲナーゼの消化力、高い生存率を達成するために重要です。第二に、コラゲナーゼ消化中には 37 ° C の水浴の心臓組織を扇動するためにそれは推奨されません。多くのプロトコルで攪拌をお勧め我々 発見 P0 心はコラゲナーゼで消化されやすい、これは不要します。最後に、心臓組織を優しく triturating コラゲナーゼの消化力の後の心筋細胞を分離するに重要です。
また、同じプロトコルを使用して、P1 と P2 の子犬の心臓組織から心筋細胞をテストしたが。ただし、これらの古い中心のサンプルの事前消化を一晩でトリプシンを十分なセル利回り (データは示されていない) を達成するために実行する必要があるとわかった。さらに、P1 と P2 の心筋細胞の細胞生存率は 60%、その他の公開研究16と同様を前後だった。P0 心筋がトリプシン事前消化、セル実行可能性の高い結果の短い時間を有効にし、これらの若い心から生成古い心より細胞外マトリックスの比較的低い量を持っていることが示唆されました。
細胞フラックス (XF) 解析細胞と分離ミトコンドリア20,21生物エネルギー関数を測定する主要な人気のある方法となっています。日には、研究の数はラット新生児心筋細胞を使用し、アジレント XF24 システム22,23,24使用の酸素消費量を測定しました。ラット細胞一般に高いセル実行可能性とここで学んだマウス心筋と比較して、アッセイの再現性を持っているとマウス由来の細胞ではなくラットの細胞を使用してこれらの研究を行った可能性が高い。本稿で説明するようにマウス新生児心筋、生物エネルギー関数を分析するためのシンプルで再現性のあるプロトコルが研究する機会を提供する遺伝子組換え動物がマウスの線で主に生成されていることを考えるマウス心筋細胞におけるミトコンドリアの機能。このメソッドは、新しいまたは既存の遺伝子操作マウス行25,26を使用して、中心部に生体エネルギー規制の新しいメカニズムの理解につながる可能性がありますデータにより簡単に翻訳できます。
本研究では、OCR に及ぼす細胞数と密度をテストしました。図 4 bに示すように、類似していた OCR 10 x 10320 × 10 の3、および 30 x 103細胞/ウェル、井戸で測定します。メッキ 30 × 103細胞/ウェル播種後 1 日以内で合流もを生産、そのは、10 x 103 30 x 103細胞/ウェルの 96 ウェル プレート、OCR の試金のための間のセルを分割することをお勧めします。興味深いことに 3 h 血清飢餓の減少した OCR がわかった。成長因子は、解糖系をアクティブにし、酸素消費27を増やす知られています。成長因子を全体的に高めることも報告された細胞の活動と心筋細胞3,28の収縮。心筋細胞の収縮では、ATP 生成2、酸素消費量に依存する必要があります。したがって、これらのデータは、血清飢餓が心筋細胞の不活性化による酸素消費量を減少させることをお勧めします。1 つの実験の設定で OCR の血清飢餓の効果のテストをお勧めします。
前述のように、ミトコンドリアは心臓機能に重要な役割を再生します。したがって、新しい調節および酸化的代謝を調節する経路を識別する心不全治療の新たな治療標的を識別する手段を提供できます。24 井戸のフォーマットと比較して条件をテストの大きい数をテストする機能のために 96 の井戸のフォーマットが用意されているこのプロトコルも高スループット画面心筋29 新しい生物エネルギー調節を識別するために容易に適応できます。.したがって、遺伝子のプロトコルを組み合わせることによってミトコンドリア変異30で OCR に及ぼす化学化合物または cDNA ライブラリーをスクリーニングするための興味深い研究を提供すること、ものなど、新生児心筋細胞を操作野生型対.代謝不良心筋細胞。
新生児と成人の心筋細胞がある多くの異なる特性や代謝機能31グルコースと脂肪酸代謝酵素32の発現レベルを含むことがあります。したがって、理想的には、そのまま心臓のモデル系としての in vitro 培養心筋細胞を使用することが重要です 1 つは酸化能力を比較できるので、さらに大人の心筋 OCR を効率的に分析するためのプロトコルを開発して新生児心筋細胞の特徴。将来の研究は、成人の心筋細胞を用いた再現システムに本手法を適応する追求する必要があります。
要約すると、プライマリの培養マウス新生仔マウス心筋の酸素消費量を分析するためのシンプルで再現性のあるプロトコルを示す.このプロトコルを使用して、孤立させて、マウス新生児心筋細胞を培養、96-well 細胞フラックス アナライザー システムを使用してこの OCR 分析を実行正常に我々 可能性があります。我々 のプロトコルは高い生存率を与える、重要なは、一貫して再現可能な結果。現在の研究は主に酸素消費量およびミトコンドリア ストレス テストに焦点が当てられます、脂肪酸酸化と心筋細胞の糖代謝変化を分析するプロトコルを簡単に適応できます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
我々 はすべてのロス ラボとマーフィー研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は NIH エンライテンメント (HL115933、HL127806) と R.S.R. に VA メリット (BX003260) アメリカ心臓協会 (14SDG17790005) によってサポートされて
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
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