Mikroelektroden-Impalement-Methode zur Aufzeichnung des Membranpotenzials aus einer kantigen mittleren Zerebralparese

Summary

Das primäre Ziel dieses Artikels ist es, Details darüber zu liefern, wie Membranpotenzial (V_m) aus der mittleren Zerebrale mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode aufzuzeichnen ist. Die kanülierte mittlere Hirnarterie wird ausgeglichen, um myogenen Ton zu erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandigen Mikroelektroden aufgespießt.

Abstract

Membranpotential (V_m) von vaskulären glatten Muskelzellen bestimmt den Gefäßtonund und damit den Blutfluss zu einem Organ. Veränderungen in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Pumpen, die V_m bei Krankheitszuständen regulieren, könnten möglicherweise V_m,Gefäßtonus und Blutfluss verändern. Daher sind ein grundlegendes Verständnis der Elektrophysiologie und die Methoden, die notwendig sind, um V_m in gesunden und kranken Zuständen genau aufzuzeichnen, unerlässlich. Diese Methode ermöglicht die Modulation von V_m mit verschiedenen pharmakologischen Mitteln zur Wiederherstellung von V_m. Obwohl es mehrere Methoden gibt, jede mit ihren Vor- und Nachteilen, bietet dieser Artikel Protokolle zur Aufzeichnung von V_m aus kanülierten Widerstandsgefäßen wie der mittleren Zerebralparese mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode. Mittlere Hirnarterien dürfen in einer Myographenkammer myogenen Ton erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandsstarken Mikroelektroden aufgespießt. Das V m-Signal wird über ein Elektrometer erfasst, digitalisiert und analysiert. Diese Methode ermöglicht ein genaues Ablesen des V_m einer Gefäßwand, ohne die Zellen zu beschädigen und ohne den Membranwiderstand zu verändern.

Introduction

Das Membranpotential (V_m) einer Zelle bezieht sich auf den relativen Unterschied der ionischen Ladung über die Plasmamembran und die relative Durchlässigkeit der Membran zu diesen Ionen. Der V_m wird durch die Differenzverteilung der Ionen erzeugt und durch Ionenkanäle und Pumpen aufrechterhalten. Ionenkanäle wie K⁺, Na⁺, und Cl^– tragen wesentlich zum ruhenden V_mbei. Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) exprimieren mehr als vier verschiedene Arten von K⁺ Kanäle¹, zwei Arten von spannungsgegated Ca²⁺ Kanälen (VGCC)², mehr als zwei Arten von Cl – Kanäle^{3, 4 , 5}, speicherbetriebene Ca²⁺ Kanäle⁶, Stretch-aktivierte Kationenkanäle^7,8und elektrogene Natrium-Kalium-ATPase-Pumpen⁹ in ihren Plasmamembranen, die alle an der Regulierung von V_mbeteiligt sind.

Der V_m von VSMCs hängt vom Lumendruck ab. In nicht unter Druck stehenden Gefäßen variiert V_m von -50 bis -65 mV, in Druckarteriensegmenten reicht V_m jedoch von -37 bis -47 mV¹⁰. Die Erhöhung des intravaskulären Drucks bewirkt, dass VSMCs¹¹depolarisieren, den Schwellenwert für die VGCC-Öffnung verringern und den Kalziumzufluss erhöhen, der zur Entwicklung des myogenen Tons^{beiträgt 12}. Im Gegenteil, in passiven oder nicht unter Druck stehenden Gefäßen wird die Membranhyperpolarisation aufgrund der hohen K +-Kanalaktivität verhindern, dass sich VGCC öffnet, was zu einem begrenzten Kalziumeintrag und einer Abnahme des intrazellulären Kalziums führt, was zu weniger Gefäßton¹³. Somit scheint V_m aufgrund von Veränderungen des Lumendrucks eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung des Gefäßtonons zu spielen, und sowohl VGCC- als auch K +-Kanäle spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von V_m.

V_m variiert je nach Schiffstyp und Art. V_m ist -54 x 1,3 mV in Meerschweinchen überlegene meenterische arterielle Streifen¹⁴, -45 x 1 mV in den mittleren Hirnarterien der Ratte bei 60 mmHg Lumendruck¹², und -35 x 1 mV in Rattenparenchymalarterien bei 40 mmHg Lumendruck¹⁵. Der ruhende V_m, der im ungestreckten Lymphmuskel der Ratte aufgezeichnet wird, beträgt -48 x 2 mV¹⁶. V_m zerebraler VSMCs ist negativer als in peripheren Arterien. Im Vergleich dazu wurden feline mittlere Hirnarterien mit einem V_m von etwa -70 mV berichtet, während mesentäre und koronare Arterien mit -49 bzw. -58 mV bzw.^17,18berichtet enden. Unterschiede im V_m über Gefäßbetten können die Unterschiede in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Natrium-Kaliumpumpen widerspiegeln.

Erhöhungen und Abnahmen von V_m werden als Membrandepolarisation bzw. Hyperpolarisation bezeichnet. Diese Veränderungen in V_m spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen, einschließlich Ionenkanalgating, Zellsignalisierung, Muskelkontraktion, und Aktion potenzielle Ausbreitung. Bei einem festen Druck verursachen viele endogene und synthetische Vasodilatatorverbindungen, die K⁺ Kanäle aktivieren, eine Membranhyperpolarisation, was zu Einer Vasodilatation^1,13führt. Umgekehrt ist eine nachhaltige Membrandepolarisation bei agonistisch-induzierter oder rezeptorvermittelter Vasokonstriktion¹⁹von entscheidender Bedeutung. V_m ist eine kritische Variable, die nicht nur den Zustrom von Ca²⁺ durch VGCC¹³ reguliert, sondern auch die Freisetzung von Ca²⁺ aus den internen Lagern^20,21 und Ca²⁺-Empfindlichkeit von die kontraktive Vorrichtung²².

Zwar gibt es mehrere Methoden zur Erfassung von V_m aus verschiedenen Zelltypen, aber die Daten, die aus der Mikroelektroden-Imprägemethode von kanülierten Gefäßen gesammelt wurden, scheinen physiologischer zu sein als Daten, die von isolierten VSMCs gewonnen wurden. Bei aufnahme von isoliertem VSMC mit aktuellen Klemmmethoden wird V_m als spontane transiente Hyperpolarisation in VSMCs²⁴angesehen. Isolierte VSMCs befinden sich nicht im Syncytium, und die Änderungen im Serienwiderstand können zum Oszillatorverhalten von V_mbeitragen. Andererseits wird das Oszillationsverhalten nicht beobachtet, wenn V_m von intakten Gefäßen aufgezeichnet wird, wahrscheinlich aufgrund des Zell-Zell-Kontakts zwischen VSMCs, die sich in der Arterie im Syncytium befinden und im gesamten Gefäß summiert werden, was zu einem stabilen V_m ^{führt. 24}. Somit ist die Messung von V_m von Druckgefäßen mit Standard-Mikroelektroden-Impalement-Technik relativ nahe an den physiologischen Bedingungen.

Die Aufnahme von V_m von kanülierten Gefäßen könnte wichtige Informationen liefern, da V_m von VSMCs, die in Syncytium sind, eine der wichtigsten Determinanten des Gefäßtons und des Blutflusses ist und die Modulation des V_m eine Möglichkeit bieten könnte, Verengung der Blutgefäße. Daher ist es wichtig, die Methodik zu verstehen, die bei der Erfassung von V_merforderlich ist. Dieser Artikel beschreibt die intrazelluläre Aufzeichnung von V_m aus kanülierten mittleren Hirnarterien (MCAs) mit einer Mikroelektroden-Impalement-Methode. Dieses Protokoll beschreibt, wie McAs, Mikroelektroden, die Einrichtung des Elektrometers und die Impalement-Methode zur Aufzeichnung von V_mdurchgeführt werden. Darüber hinaus werden repräsentative Daten, häufige Probleme, die bei der Verwendung dieser Methode aufgetreten sind, und potenzielle Probleme diskutiert.

Protocol

Die männlichen Ratten wurden in der Animal Care Facility des UMMC untergebracht, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zugelassen ist. Die Tiere hatten während der gesamten Studie freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere wurden in einer kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 24 °C bei 2 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60–80 % und 12 h Licht-/Dunkelzyklen gehalten. Alle Protokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der UMMC genehmigt. <p …

Representative Results

Die vorgestellte Methode kann zuverlässig zur Aufzeichnung von Vm in kanülierten Gefäßen eingesetzt werden. Eine kurze Prozedur, die beschreibt, wie MCA aus dem Gehirn isoliert werden kann, ist in Abbildung 1Adargestellt. Nach der Trennung des Gehirns vom Schädel wurde das MCA seziert und in eine Petrischale mit niedrigem Kalzium-PSS gelegt. Ein Teil des anhaftenden Bindegewebes wurde zusammen mit MCA mit Federschere und Zange seziert, um eine…

Discussion

Dieser Artikel enthält die notwendigen Schritte, wie eine scharfe Mikroelektroden-Impalement-Methode verwendet werden kann, um V_m aus einer kanülierten Gefäßzubereitung aufzuzeichnen. Diese Methode ist weit verbreitet und bietet qualitativ hochwertige, konsistente Aufnahmen von V_m, die eine Vielzahl von experimentellen Fragen beantworten.

Einige kritische Überlegungen und Schritte zur Fehlerbehebung werden hier beschrieben, um den Erfolg der Methode sicherzustellen. …

Materials

Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761