Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR
Summary
Este estudio demuestra el uso de citometría de flujo para detectar la producción de (ROS) las especies reactivas de oxígeno resultante de la activación de la FcγR. Este método puede utilizarse para evaluar los cambios en el antimicrobiano y función de los fagocitos en respuesta a complejos inmunes, microorganismos opsonizadas o FcγR directa Cross-linking de señalización redox.
Abstract
La explosión oxidativa o respiratoria se utiliza para describir el rápido consumo de oxígeno y la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) por los fagocitos en respuesta a varios estímulos inmunes. ROS generados durante la activación inmune ejerce potente actividad antimicrobiana sobre todo a través de la capacidad de ROS para dañar el ADN y las proteínas, causando la muerte de los microorganismos. Ser capaz de medir la producción de ROS reproducible y con facilidad es necesario para evaluar la contribución de varias vías y moléculas para este mecanismo de defensa del huésped. En este trabajo, demostrar el uso de sondas fluorescentes y citometría de flujo para detectar la producción de ROS. Aunque ampliamente utilizado, es muy problemático, especialmente en cuanto a medición de ROS inducida por estímulos específicos y no mitogénicos medición fluorescente de ROS. Presentamos una metodología detallada para la detección de ROS generados como resultado de la estimulación específica de FcγR comenzando con generación de macrófago, cebado, coloración, FcγR Cross-linking y terminando con el análisis cytometric del flujo.
Introduction
Especies reactivas del oxígeno (ROS) son moléculas reactivas o radicales libres que son subproductos de la respiración aeróbica (revisado en 1). Estas incluyen el anión superóxido, peróxido, peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo y los iones hidroxilo, entre otros. En condiciones fisiológicas normales, ROS son producidos principalmente por las mitocondrias y oxidasas de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y son desintoxicados rápidamente por varias enzimas y proteínas tales como la superóxido dismutasa y glutatión. Una exagerada producción de ROS o un defecto en la capacidad de eliminar ROS puede resultar en estrés oxidativo, por el que especies reactivas de oxígeno promueven el daño de las proteínas, lípidos y ADN llevando a estados patológicos de la enfermedad o la muerte y el estrés celular. Sin embargo, actualmente se aprecia que ROS también pueden actuar como moléculas de señalización (redox signaling), y modificación mediada por ROS de diversas moléculas y productos intermedios de la vía puede influenciar metabolismo celular, proliferación, supervivencia, inflamatoria señalización y envejecimiento2. En las células fagocíticas, ROS juega un papel esencial en la prestación de la actividad antimicrobiana durante el llamado “Estallido respiratorio”1,3,4,5,6. Durante la respuesta de los fagocitos a los estímulos externos, componentes de la NADPH oxidasa complejo (p40phox, p47phox, p67phox) translocan desde el citosol a la membrana phagosomal que contiene la gp91phox y p22phox subunidades, y junto con las acciones de Rac1/2, forman un completamente funcional NADPH oxidasa complejo de la enzima. La oxidasa de NADPH montada entonces utiliza NADPH para reducir el oxígeno a superóxido dentro de la vacuola phagosomal. Aniones superóxido pueden dañar directamente o dismutated en peróxido de hidrógeno. Superóxido y peróxido de hidrógeno pueden reaccionar con otras moléculas para generar a radicales hidroxilo altamente reactivo. Daño es mediado por la reacción de estos ROS con racimos de hierro-azufre en proteínas o haciendo base oxidación del ADN, en última instancia conduce al limitado metabolismo microbiano o la muerte del microbio5. La importancia de la enzima oxidasa de NADPH complejo y ROS producidos durante la explosión respiratoria se ilustra clínicamente en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (CGD)7,8,9, 10. individuos con CGD poseen mutaciones en gp91phox, resultando en una falta de producción de ROS y la susceptibilidad a infecciones recurrentes con bacterias y hongos que normalmente no son una preocupación con los individuos inmunocompetentes. Por lo tanto, si estudiar oxidativo estrés redox señalización y defensa del huésped, pudiendo medir la producción de ROS en tiempo real es un esfuerzo útil.
Múltiples ensayos se han utilizado para la producción de ROS de medida o los resultados de estrés oxidativo11,12,13. Entre éstos, uno de los más utilizados es la sonda fluorescente 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH2-DA)14. Esta molécula es incoloro y lipofílicas. Difusión de DCFH2-DA a través de la membrana celular permite que se actuó por esterasas intracelulares, que deacetylates DCFH2, haciéndola celular impermeable. Las acciones de múltiples tipos de ROS (peróxido de hidrógeno, peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico y los radicales Peroxoborato) DCFH2 oxidan en DCF que es fluorescente (divulgado Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) y pueden ser detectados usando un flujo de citómetro equipado con un filtro estándar de fluoresceína (FL1 canal). Superóxido no reacciona fuertemente con DCFH2 pero puede reaccionar con otra sonda dihydroethidium (DHE) para producir el producto fluorescente 2-hydroxyethidium (así como otros productos de la oxidación de superóxido-independiente fluorescente)15. Los productos fluorescentes de oxidación DHE pueden detectarse con una longitud de onda de excitación de 518 nm y una longitud de onda de la emisión de 605 nm (FL2 canal). Aunque relativamente fáciles de usar, la utilización de estas sondas para la detección de ROS requiere conocimiento de sus limitaciones y cuidadosa incorporación de tinción procedimientos y controles en el ensayo específico se realiza para poder tener validez experimental resultados y conclusiones. El protocolo siguiente muestra el uso de un kit disponible en el mercado que emplean estos 2 puntas de prueba diseñadas para medir ROS por citometría de flujo. Mancha preparados macrófagos derivados de médula ósea con estas puntas de prueba e inducir la producción de ROS a través de cross-linking FcγR. Presentamos datos representativos obtenidos usando este protocolo y recalcar las precauciones apropiadas que se deben emprender para la experimentación exitosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-DA y detección basada en DHE de ROS es una técnica ampliamente utilizada14,15. Facilidad de uso y la adaptabilidad de estas sondas ROS para microplacas cinética formatos, análisis de fluorescencia microscopía o flujo cytometric ha contribuido a su popularidad. Sin embargo, en nuestros estudios de las funciones de macrófagos mediada por FcγR, no parecía ser un protocolo estándar para la realización de este ensayo para el análisis cytome…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a otros miembros del laboratorio de Tigno Aranjuez como Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy, Roopin Singh por su ayuda en el mantenimiento de colonias de mantenimiento y el ratón de laboratorio. Apoyo para esta investigación fue proporcionado por grant R00 HL122365 y fondos de puesta en marcha a J.T.T-A.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Referenzen
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