Summary

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

Published: April 09, 2019
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Summary

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.

Abstract

Die frühen screening Nervensystem Medikamente auf eine sachdienliche und zuverlässig in Cellulo BBB Modell für ihre Verbreitung und ihre Wechselwirkung mit der Barriere und die Anwesenheit von besteht noch ein ungedeckter Bedarf. Um diese Lücke zu füllen, entwarfen wir ein 2D in Cellulo Modell, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer Polyesters poröse Membran Kultur einfügen BBB Menschmodell mit einer Minibrain von einer Tri-Kultur der menschlichen Gehirnzellen (Neuronen, Astrozyten und Mikroglia-Zellen) gebildet. Die BBB-Minibrain erlaubt uns, testen Sie den Transport von eine neuroprotektive Arzneimittelkandidat (z. B. Neurovita), durch die BBB, bestimmen die spezifische Ausrichtung dieses Moleküls zu Neuronen und zu zeigen, dass die neuroprotektive Eigenschaft des Medikaments nach erhalten blieb das Medikament hatte die BBB überschritten. Wir haben auch gezeigt, dass BBB-Minibrain ein interessantes Modell stellt, im Laufe der Viruspartikel durch die Endothelzellen Schranke zu erkennen und die Infektion der Minibrain durch Neuroinvasive Viruspartikel zu überwachen. Die BBB-Minibrain ist ein zuverlässiges System, einfach zu handhaben für Forscher ausgebildet in Zellkulturtechnik und prädiktiv für die Gehirn-Zellen-Phänotypen nach Behandlung oder Beleidigung. Das Interesse eines solchen Cellulo testen wäre zweierlei: Einführung von Konzentrationsrisiken Schritte schon früh in der Entwicklung von Medikamenten auf der einen Seite und Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen auf der anderen Seite.

Introduction

Das Gehirn wird von den Körperkreislauf durch eine nicht-durchlässigen Struktur getrennt, die den Austausch zwischen der Anwesenheit und das Blut, die Blut – Hirn-Schranke (BBB) genannt einschränkt. Meist bestehend aus zerebralen Endothelzellen, interagiert die BBB dynamisch mit perivaskuläre Mikroglia, Astrozyten und Neuronen in Anwesenheit von den benachbarten. Die drei Hauptfunktionen der BBB sind die Erstellung und Pflege der Ionischen Homöostase für neuronale Funktionen, Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und Schutz vor toxischen Verletzungen oder Eintrag von Krankheitserregern1,2, die dazu beitragen die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und seiner Funktionen3. Diese Barriere ist so effizient, dass nur wenige Medikamente die BBB4,5überqueren können. Derzeit bestehen die verfügbaren Methoden vorhersagen, ob ein Molekül die BBB passieren und in das Gehirn diffundieren von ex-Vivo-Studien auf Autopsie, Bild Materialverfolgung in das Gehirn der Probanden mittels MRT (Magnet-Resonanz-Tomographie) oder PET (Position emission Tomographie) oder Pharmakodynamik und pharmakokinetischen präklinischen Studien im Tiere6,7,8. Diese Techniken und Modelle haben einige Einschränkungen, z. B. der begrenzten Auflösung der PET und die geringe Sensitivität der MRT6,8, die Schwierigkeit zu Molekülen (z. B. basierend Antikörpermoleküle zum Beispiel) so schlecht quantifizieren dringen Sie die Gehirn-7, und für die präklinische Studien Sie, ihre hohen Kosten und Resort von Tierversuchen.

Der letzte Punkt ist wichtig, weil nach der 3R Regeln, (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung von Tierversuchen) die regulatorischen Behörden gebeten haben, entwickeln die Forscher dringend wissenschaftlich präzise Alternative zum Tier Experiment9,10,11,12,13,14,15.

In den letzten Jahrzehnten mehrere in-vitro-Modelle von BBB vorgeschlagen wurden16,17,18 durch den Anbau auf Filter Membran fügt Endothelzellen aus verschiedenen Arten wie Maus, Ratte, Rind und Schwein. Der menschlichen Spezies angeht, die knappe und schwere Verfügbarkeit von Primärzellen aufgefordert die Forscher menschliche Modelle basierend auf verewigt Gehirn endothelial Zellen oder menschliche Stammzellen19,20zu entwickeln, 21. Diese Barrieren sind richtige in-vitro-Surrogate von BBB, vorausgesetzt, dass sie Endothelzellen Marker, engen Kreuzung Marker, Efflux-Transporter, Solute Carrier, Rezeptoren ausdrücken, und reagieren auf die endotheliale Reize 20. Ein paar BBB-Modelle mit Membran Filtereinsätze beschichtet mit Endothelzellen und anderen Zelltypen (z.B. Astrozyten, Neuronen oder Perizyten22,23,24) wurden untersucht. Das Ziel dieser Co Kulturen war die BBB physikalischen Eigenschaften zu erhöhen, indem unter Ausnutzung der Sekretion der lösliche Faktoren von Astrozyten/Neuronen oder Perizyten.

Dennoch enthält keines dieser Modelle in Anwesenheit von zu studieren und das Schicksal der ein Arzneimittelkandidat vorherzusagen, sobald es die Barriere bestanden hat. Daher unser Ziel bestand darin, eine in Cellulo bauen Blut/Hirn-Schnittstelle, die BBB-Minibrain, durch die Kombination ein BBB-Modell und eine Kultur der gemischten Gehirnzellen in einem einzigen Kit. Die BBB-Minibrain verwendet ein Kultursystem bestehend aus einem porösen Filter in einen Brunnen von einem multiwell Zellplatte Kultur eingefügt. Der Filter ist mit hCMEC/D3 Zellen eines menschlichen Gehirns Endothelzellen Linie beschichtet, die hochzuverlässige für BBB Drogentests25,26,27, bilden die BBB nachgewiesen worden ist. Die Minibrain ist ein Co differenzierte Kultur der menschlichen Neuronen und Astrozyten, abgeleitet vom NTera/Cl2.D1 Zelle Zeile28,29 gemischt zusammen mit der menschlichen Mikroglia-Zell-Linie CHME/Cl530 im Verhältnis entspricht der Mikroglia vs. Neuron-Astrozyten Verhältnisse der Gehirn-31ist in der Unterseite der Platte gut kultiviert.

Neben dem Studium Durchgang von Drogen über die BBB und ihr Schicksal in das Parenchym, könnte die Blut-Hirn-Schnittstelle in Cellulo Modell ein mächtiges Werkzeug, um den Eintrag von Krankheitserregern in das Gehirn (Neuroinvasiveness), die Dispersion ins Gehirn (Neurotropism) Adresse und die Toxizität (Neurovirulence), die sie auf Gehirn Parenchymzellen ausüben können. Neurovirulence und Neuroinvasiveness Studien würde profitieren von der Entwicklung eines effizienten Cellulo Modell und vorteilhaft sein, Tiermodellen zu ersetzen. Mit der BBB-Minibrain Kit32, wir bewiesen Neuroinvasive Phänotyp selten viral Mutanten, die angesammelt in French Neurotropic Virus-Stamm des Gelbfieber-Virus (z.B. FNV-YFV33,34) zur Vorbereitung einer Lebendimpfstoff YFV und den Durchgang von einem neurogenerative und neuroprotektive Biomolekül genannt Neurovita (bezeichnet als NV fortan im Manuskript)35eingestellt. Da NV weder kreuzt natürlich die Zellmembran noch die BBB, NV wurde eine einzelne Kette Antikörpers von Lamas, die Kreuze der biologischen Membranen, einschließlich der BBB und fungiert als eine Zelle eindringen Molekül (CPM)36mit der Variable Teil (LHKW) verschmolzen. Die CPM-Eigenschaft des FHKW scheint der isoelektrischen Punkt und die Länge der LHKW37abhängen.

In diesem Cellulo Test sollen es ermöglichen, die Moleküle zu sortieren, die potenziell die BBB vor Durchführung der pharmakokinetischen und Pharmakodynamik Analyse bei Tieren, und im Idealfall in der gleichen Zeit in der Lage sein, ihr Verhalten in der nervösen vorherzusagen kreuzen könnte Parenchym. Dieses System ist biologisch relevante und einfach einrichten und verarbeiten von Fachleuten gut ausgebildet in Zelle Kultur26,29,30,38. Das Interesse eines solchen Cellulo testen wäre zweifach: Reduzierung der Kosten der präklinischen Tests auf der einen Seite und Verringerung des Einsatzes von Tierversuchen auf der anderen Seite.

Protocol

(1) Zelle Kultur Arbeit der Ntera/CL2. D1 zur Vorbereitung einer Kokultur Post-mitotische hNeurons und hAstrocytes (NT2-n/a) Hinweis: Dies ist die Komponente des Minibrain (Abbildung 1). Kultivierung der Ntera/Cl2.D1 Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen Zellen aus flüssigem Stickstoff-Tank. Halten Sie auf dem Eis. Auftauen der Zellen schnell in einem 37 ° C-Wasserbad. Die Zellen in einer 15 mL Tube mit 10 mL der ko…

Representative Results

Die BBB-Minibrain ist ein in Cellulo experimentellen Modell der Blut-Hirn-Schnittstelle. Die BBB-Minibrain ist das Polyester Membran Kultur einfügen System eingerichtet, ein Blut-Fach auf der oberen Ebene und ein Gehirn-Fach auf der unteren Ebene der Blut-Hirn-Schnittstelle (Abb. 2AB) zu imitieren. Es besteht aus einem luminalen Fach mit hCMEC/D3 Endothelzellen auf…

Discussion

In diesem Artikel wir gezeigt, wie man eine in Cellulo bauen Blut/Hirn-Schnittstelle, die BBB-Minibrain, durch die Kombination einer BBB-Modell und eine Kultur des Gehirn zerebrale Zellen (Minibrain) in einem einzigen Kit gemischt. Dieses System ist biologisch relevante, einfach einzurichten und für Experimentatoren, die gut ausgebildet in der Zellkultur zu behandeln.

Wie für jedes andere in-vitro-Modell von BBB würde zuverlässige Ergebnisse erzielt werden, wenn drastische Kontrolle der Di…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch interne Zuschüsse vom Institut Pasteur, darunter einen förderlich Grant (PTR-435) und durch einen Zuschuss “Contrat de Soutien à la Recherche” zur Verfügung gestellt von Sanofi Pasteur, Institut Pasteur. A. da Costa wurde unterstützt von der Sanofi-Pasteur Grant und Florian Bakoa ist Empfänger von einem Promotionsstipendium zur Verfügung gestellt von ANRT (Association Nationale De La Recherche et De La Technologie). Wir sind verpflichtet, Pr Pierre-Olivier Couraud und Dr Florence Miller für hilfreiche Diskussionen.

Materials

12 well plates Corning 3336
5-fluoro-2’deoxyuridine Merck-Sigma Aldrich F0503
85mm Petri Dish Sarstedt 83-3902-500
Anti-Nf200 Merck-Sigma Aldrich N4142
β-mercapto-ethanol Merck-Sigma Aldrich M3148
CHME/Cl5 Unité de Neuroimmunologie Virale On request to Dr Lafon
CMC Calbiochem 217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside Merck-Sigma Aldrich C1768
Dark 96 well plates Corning 3915
DMEM F12 Thermofisher Scientific 31330-038
DMSO Merck-Sigma Aldrich D2650
Endogro IV Millipore SCME004 endothelial cell medium
Ethanol Carlo Erba 529121
FBS Hyclone SV30015-04
Formaldehyde Merck-Sigma Aldrich 252549
GIEMSA RAL Diagnostic 320310
Goat-Anti Mouse Jackson Immuno Research 115-545-003
Goat-Anti Rabbit Thermofisher Scientific R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14025-100
hCMEC/D3 Cedarlane CLU512
Hepes 1M Thermofisher Scientific 15630-070
Hoescht 33342 Merck-Sigma Aldrich 33263
Laminine Merck-Sigma Aldrich L6274
L-glutamin Thermofisher Scientific 25030-024
Lucifer Yellow Merck-Sigma Aldrich L0259
MEM 10X Thermofisher Scientific 21430
MEM 1X Thermofisher Scientific 42360
Ntera/Cl2D.1 ATCC CRL-1973
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
PBS without Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14190
PBS-Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14040-091
Pen/Strep Eurobio CXXPES00-07
Poly-d-Lysine Merck-Sigma Aldrich P1149
Prolong Gold Thermofisher Scientific P36930
Qiashredder QIAGEN 79656
Rat Collagen I Cultrex 3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans Merck-Sigma Aldrich R2625
RNA purification kit QIAGEN 74104
SDS Merck-Sigma Aldrich L4509
Sodium bicarbonate 5.6% Eurobio CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate Thermofisher Scientific 11360
T75 Cell+ Flask Sarstedt 83-1813-302 Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell Corning 3460 polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA Merck-Sigma Aldrich T3924
Ultra Pure Water Thermofisher Scientific 10977-035
Uridine Merck-Sigma Aldrich U3750
Versene Thermofisher Scientific 15040-033 EDTA
YFV-FNV IP Dakar Vaccine vial

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da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa, F., Afonso, P., Ceccaldi, P., Lafaye, P., Lafon, M. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain. J. Vis. Exp. (146), e59220, doi:10.3791/59220 (2019).

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