Gebruik van in vivo single-Fiber opname en intact dorsale wortel ganglion met bijgevoegde Sciatische zenuw om het mechanisme van geleidings falen te onderzoeken

Summary

Single-Fiber opname is een effectieve elektrofysiologische techniek die toepasbaar is op de centrale en perifere zenuwstelsels. Samen met de voorbereiding van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw, het mechanisme van geleiding falen wordt onderzocht. Beide protocollen verbeteren het begrip van de relatie van het perifere zenuwstelsel met pijn.

Abstract

Single-Fiber opname is de laatste decennia een klassieke en effectieve elektrofysiologische techniek geweest vanwege de specifieke toepassing voor zenuwvezels in de centrale en perifere zenuwstelsels. Deze methode is met name van toepassing op dorsale wortel ganglia (DRG), die primaire sensorische neuronen zijn die een pseudo-unipolaire structuur van zenuw processen vertonen. De patronen en kenmerken van de actie potentialen doorgegeven langs axonen zijn beschrijfbare in deze neuronen. De huidige studie gebruikt in vivo single-Fiber opnames om de geleiding falen van de sciatische zenuwen in volledige Freund van adjuvans (CFA) behandelde ratten te observeren. Omdat het onderliggende mechanisme niet kan worden bestudeerd met behulp van in vivo single-Fiber opnames, worden Patch-clamp-opnames van DRG neuronen uitgevoerd op preparaten van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw. Deze opnames onthullen een positieve correlatie tussen geleidings falen en de stijgende helling van de nahyperpolarisatie potentiaal (AHP) van DRG-neuronen bij met CFA behandelde dieren. Het protocol voor in vivo enkelvoudige glasvezel opnames maakt de classificatie van zenuwvezels mogelijk via de meting van de geleidings snelheid en het monitoren van abnormale omstandigheden in zenuwvezels bij bepaalde ziekten. Intact DRG met bijgevoegde perifere zenuw maakt observatie van de activiteit van DRG neuronen in de meeste fysiologische omstandigheden. Overtuigend, single-Fiber opname gecombineerd met elektrofysiologische opname van intacte Drg’s is een effectieve methode om de rol van geleidings falen tijdens het analgetische proces te onderzoeken.

Introduction

De normale overdracht van informatie langs zenuwvezels garandeert de normale werking van het zenuwstelsel. Abnormale werking van het zenuwstelsel wordt ook weerspiegeld in de elektrische signaaloverdracht van zenuwvezels. Zo kan de mate van demyelinisatie bij centrale demyelineaflaesies worden geclassificeerd via vergelijking van veranderingen in zenuw geleidings snelheid voor en na interventie toepassing¹. Het is moeilijk om intracellulair record zenuwvezels, behalve in speciale preparaten zoals de inktvis reus axon². Daarom is elektrofysiologische activiteit alleen beschrijfbare via de extracellulaire opname van enkelvoudige vezels. Als een van de klassieke elektrofysiologische methoden, heeft single-Fiber opname een langere geschiedenis dan andere technieken. Echter, minder elektrofysiologen grijpen deze methode ondanks de uitgebreide toepassing. Daarom is een gedetailleerde introductie van het standaardprotocol voor de opname van één vezel nodig voor de juiste toepassing.

Hoewel verschillende Patch-clamp technieken moderne elektrofysiologische studie hebben gedomineerd, speelt single-Fiber opname nog steeds een onvervangbaar rol bij het opnemen van de activiteiten van zenuwvezels, vooral vezels die perifeer gevoel overbrengen met hun sensorische cel lichaam gelegen in dorsale wortel ganglion (DRG). Het voordeel van het gebruik van single-Fiber opname hier is dat in vivo Fiber Recording een lange observatietijd biedt met de capaciteit om reacties op natuurlijke stimuli op te nemen in preklinische modellen zonder verstoring van de intracellulaire omgeving^{3 , 4}.

Een toenemend aantal studies in de afgelopen twee decennia heeft onderzocht complexe functies langs zenuwvezels⁵, en geleiding falen, die wordt gedefinieerd als een staat van mislukte zenuw impuls transmissie langs de axon, was aanwezig in veel verschillende perifere zenuwen^6,7. De aanwezigheid van geleidings falen in ons onderzoek diende als een intrinsiek Zelfremmend mechanisme voor de modulatie van aanhoudende Nociceptieve input langs C-vezels⁸. Dit geleidings falen was significant verzwakt onder de voorwaarden van hyperalgesia^4,9. Daarom, gericht op de factoren die betrokken zijn bij conductie falen kan een nieuwe behandeling voor neuropathische pijn vertegenwoordigen. Om het geleidings falen te observeren, moet het afvuren patroon worden geregistreerd en geanalyseerd op basis van opeenvolgend geloosde spikes op basis van single-Fiber opname.

Om het mechanisme van geleidings falen grondig te begrijpen, is het noodzakelijk om de transmissie eigenschappen van de axon te identificeren, of preciezer, de membraan eigenschappen van DRG-neuronen, gebaseerd op hun pseudo-unipolaire anatomische eigenschappen. Veel eerdere studies op dit gebied zijn uitgevoerd op gezien DRG neuronen^10,11, die mogelijk niet haalbaar voor het onderzoek van de geleiding falen als gevolg van twee obstakels. Eerste, verschillende mechanische en chemische methoden worden gebruikt in het dissociatie proces te vrije DRG neuronen, die kan resulteren in ongezonde cellen of verander het fenotype/eigenschappen van de neuronen en Verwar de bevindingen. Ten tweede, de bijgevoegde perifere zenuwen zijn in principe verwijderd, en geleiding falen verschijnselen zijn niet waarneembaar in deze preparaten. Daarom is een preparaat van intact DRG neuronen met een bijgevoegde zenuw verbeterd om te voorkomen dat de bovengenoemde obstakels.

Protocol

Het huidige protocol volgde de leidraad voor het beleid van de Amerikaanse volksgezondheid over de humane verzorging en het gebruik van proefdieren, en het Comité voor de ethiek van dierproeven van de vierde militaire medische universiteit keurde het protocol goed. 1. dieren Verdeel 24 Sprague-Dawley ratten (4-8 weken oud) in twee groepen. Produceer volledig Freund’s adjuvans (CFA) model door intraplantar injectie van 100 μL CFA in één groep van 14 ratten en een andere groep van …

Representative Results

De uitkomst van het single-Fiber opname protocol is afhankelijk van de kwaliteit van de vezel dissectie. Het dier voor in vivo experimenten moet in een goede situatie verkeren om de zenuw stam gezond te houden voor gemakkelijk dissectie (zie advies in de sectie discussie). Een drug toepassing bad is nodig in veel gevallen voor de levering van geneesmiddelen op vezels. Figuur 1 illustreert hoe de in vivo single-Fiber opname werd bediend (Figuur 1a) en presenteert een klassiek…

Discussion

Hoewel recente studies calcium beeldvorming van DRG-neuronen in vivo¹⁶hebben bereikt, blijft het uitvoeren van in vivo Patch-clamp-opnames van individuele DRG-nociceptoren uiterst uitdagend. Daarom is een in vivo single-Fiber aanpak voor het pijn veld van blijvende betekenis. Single-Fiber opname in dit protocol laat objectieve observatie van geleidings falen verschijnselen toe, en de combinatie van deze techniek met het ex vivo preparaat dat in de huidige studie is ontwikkeld, maakt het onderzoek …

Materials

Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
			experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37oC
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia