Neste manuscrito, estabelecemos um método de alto throughput para quantificar a atividade da fosfatase alcalina na cultura de S. aureus biofilme da placa de 96 poços de cultura de tecidos
Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) é uma enzima comum expressada em células procariotas e eucariotas. Ele catalisa a hidrólise de monoésteres de fosfato de muitas moléculas em pH básico e desempenha um papel indispensável no metabolismo de fosfato. Nos seres humanos, eucariótica ALP é um dos sinais de enzimática mais frequentemente utilizados no diagnóstico de várias doenças, tais como colestase e raquitismo. Em S. aureus, ALP é detectado exclusivamente na membrana celular; também é expressa como uma forma secretória também. No entanto, pouco se sabe sobre sua função na formação de biofilme.
O objetivo deste manuscrito é desenvolver um ensaio rápido e confiável para medir a atividade da ALP em S. aureus biofilme que não necessita de isolamento da proteína. Usando p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato, medimos a atividade da ALP em S. aureus biofilme formado em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Atividade baseou-se na formação do produto solúvel reação medido por 405 absorvância nm. A natureza de alta taxa de transferência do método 96 cultura pocos placa fornece um método sensível e reprodutível para ensaios de atividade ALP. O mesmo experimental setup também pode ser estendido para medir outros marcadores moleculares extracelulares relacionados à formação de biofilme.
Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ubiquitously é expresso em ambas as células procariotas e eucariotas1. Isso pode catalisar a hidrólise de monofosfato de moléculas diferentes, tais como nucleotídeos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato e anidridos de ácido fosfórico. Em humanos, ALP eucariótica está presente em muitos tecidos, incluindo fígado, ossos, intestino e placenta2. Ela desempenha papel importante na fosforilação de proteínas, bem como do crescimento celular, apoptose, processos de células-tronco e mineralização óssea normal. Eucariótica ALP é um indicador chave do soro para a presença de doenças nos ossos, fígado e outros tecidos/órgãos quando elevada3,4.
ALP procariótica foi detectada em uma variedade de células bacterianas, incluindo e. coli5,6,de S. aureus7 e algumas bactérias do rúmen comum no solos8. Atividade bacteriana de ALP tem sido usada como um biossensor na detecção de pesticidas, metais pesados9 e contaminação bacteriana10. A expressão constitutiva de ALP tem sido usada para identificar os estafilococos11 e para diferenciar Serratia Enterobacter12. Sugere-se ainda mais que a produção de ALP constitutiva está correlacionada com patogenicidade em estafilococos13. Embora o ALP tem sido estudada em diferentes configurações3,4, ainda pouco é relatado pela sua atividade e função em culturas de biofilmes.
Um biofilme tem sido documentado para ter uma vida diferente funcionamento bacteriana em comparação com o seu homólogo de vida livre célula bacteriana14. Em S. aureus, a formação de biofilme foi identificada em uma variedade de condições clínicas e contas para a resistência aos antibióticos e inflamação crônica15,16. Muitas moléculas tinham sido relatadas para ser encontrado em uma matriz de biofilme como polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos e lipídios, mas o mecanismo de formação de biofilme não é totalmente compreendida14. Para entender o papel de ALP na formação de biofilmes, nós cultivadas biofilmes de S. aureus em placas de cultura de pocos 96 e mede a atividade ALP usando pará-nitrofenilfosfato (pNPP).
A molécula pNPP é um substrato de ready-to-use para ALP e tem sido amplamente utilizado para medir a atividade ALP6,17,18. Este ensaio colorimétrico baseia-se na conversão de pará-nitrofenil fosfato (pNPP) para pará-nitrofenol, resultando em um produto colorido em 405 nm. Comparado a outro ensaio ALP convencional, tais como eletroforese19, precipitação de aglutininas (WGA) de germe de trigo, do gel de agarose e WGA-HPLC20, este ensaio é altamente específico, sensível, fácil de reproduzir e mais importante, permite para alta taxa de transferência.
No nosso ensaio, usamos pNPP como o substrato ALP. Esta é uma solução de trabalho projetada para ELISA e a diluição não é necessária. Após a hidrólise por ALP, um produto amarelo desenvolve e pode ser medido em 405 nm. No final da reação enzimática, brevemente centrifugadas a placa bem 96 e transferido o sobrenadante para um prato bem 96 fresco para medir a absorvância usando o leitor de placa. Achamos que essa etapa de centrifugação extra é crítica, pois aumenta a consistência de absorbância em 405 n…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a William Rainey Harper College e a Universidade de Illinois em Chicago para a facilidade de conduzir as experiências. Agradecemos também o McGraw Hill Foundation por seu apoio generoso.
Agar | VWR | 9002-18-0 | |
Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
Gluose | VWR | 50-99-7 | |
NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
Tryptic Soy Agar 15g / L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose…………………………………. 2.50 Dipotassium phosphate………………2.50 |
VWR | 90006-098 | |
96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |