Kolorimetrischen Analyse der alkalischen Phosphatase Aktivität in S. Aureus Biofilm
Summary
In diesem Manuskript gründeten wir eine Hochdurchsatz Methode zur Quantifizierung der alkalischen Phosphatase-Aktivität in S. Aureus Biofilm Kultur aus Gewebekultur 96-Well-Platte
Abstract
Alkalischer Phosphatase (ALP) ist eine gemeinsame Enzym in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen exprimiert. Es katalysiert die Hydrolyse von Phosphat Monoesters aus vielen Molekülen bei grundlegenden pH und Phosphat-Stoffwechsel spielt eine unverzichtbare Rolle. Beim Menschen ist eukaryotische ALP eines der am häufigsten verwendete enzymatische Signale bei der Diagnose verschiedener Krankheiten, wie z. B. Cholestase und Rachitis. In S. Aureus, ALP wird ausschließlich auf der Zellmembran erkannt; Es wird auch als sekretorischen Form sowie ausgedrückt. Allerdings ist wenig über seine Funktion im Biofilmbildung bekannt.
Dieses Manuskript soll einen schnellen und zuverlässigen Assay zur ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm zu messen, die kein Protein Isolierung erfordert zu entwickeln. Mit p-Nitrophenyl-Phosphat (pNPP) als Substrat, messen wir ALP Aktivität in S. Aureus Biofilm in 96-Well-Zellkultur-Platten gebildet. Aktivität stützte sich auf die Bildung der lösliche Reaktionsprodukt von 405 nm Absorption gemessen. Die hohen Durchsatz Natur 96 gut Gewebekultur-Platte-Methode bietet eine sensible und reproduzierbare Methode zur ALP Aktivität Assays. Die gleichen experimentellen einrichten kann auch zur Messung der anderen extrazellulären molekulare Marker im Zusammenhang mit Biofilmbildung erweitert werden.
Introduction
Alkalischer Phosphatase (ALP) drückt sich ubiquitär in beide prokaryotischen und eukaryotischen Zellen1. Es kann katalysieren die Hydrolyse von Monophosphate aus unterschiedlichen Molekülen wie Nukleotide, Proteine, Alkaloide, Phosphat Ester und Anhydride der Phosphorsäure. Beim Menschen ist die eukaryotische ALP in vielen Geweben einschließlich Leber, Knochen, Darm und Plazenta2. Es spielt eine wichtige Rolle in Protein-Phosphorylierung, Zellwachstum, Apoptose, Stammzell-Prozesse sowie normale skelettartigen Mineralisierung. Eukaryotische ALP ist auch eine wichtige Serum-Indikator für das Vorliegen von Krankheiten in Knochen, Leber und andere Gewebe/Organe, wenn erhöht3,4.
Prokaryotische ALP wurde in einer Vielzahl von bakteriellen Zellen, einschließlich der E. Coli–5, S. Aureus6,7 und einige gemeinsame Pansen-Bakterien in die Böden8erkannt. Bakterienaktivität ALP wurde als Biosensor zur Erkennung von Pestiziden, Schwermetallen9 und bakterielle Kontamination10verwendet. Die konstitutive Expression von ALP wurde Staphylokokken11 identifizieren und Enterobacter12 Serratia unterscheiden verwendet. Es wird weiter vorgeschlagen, dass konstitutive ALP-Produktion mit Pathogenität Staphylokokken13korreliert ist. Obwohl in verschiedenen Einstellungen3,4, ALP untersucht worden ist noch wenig für seine Tätigkeit und Funktion in Biofilmen Kulturen berichtet.
Ein Biofilm ist dokumentiert worden, um ein anders funktionierenden bakterielle Leben im Vergleich zu seinen frei lebende Bakterienzelle Gegenstück14haben. In S. Aureuswurde die Bildung von Biofilm in einer Vielzahl von Krankheitsbildern und Konten für die Antibiotika-Resistenz und chronische Entzündungen15,16identifiziert. Viele Moleküle war berichtet worden, um in einem Biofilm-Matrix wie Polysaccharide, Proteine, Nukleinsäuren und Lipiden gefunden werden, aber der Mechanismus der Biofilmbildung ist nicht vollständig verstandenen14. Um zu verstehen, die Rolle der ALP in Biofilmbildung, wir S. Aureus Biofilme in 96 gut Gewebekultur Platten kultiviert und die ALP-Aktivität mit Para-Nitrophenylphosphate (pNPP) gemessen.
Das Molekül pNPP ist ein Ready-to-Use-Substrat für die ALP und verbreitet, ALP Aktivität6,17,18zu messen. Dieser farbmetrischen Assay basiert auf der Umwandlung von Para-Nitrophenyl Phosphat (pNPP), Para-Nitrophenol führt ein farbiges Produkt bei 405 nm. Im Vergleich zu anderen herkömmlichen ALP-Assay, wie Agarose gel Elektrophorese19, Weizenkeime Agglutinin (WGA) Niederschlag und WGA-HPLC20, dieser Test hochspezifisch ist, ermöglicht empfindlich, leicht zu reproduzieren, und die meisten vor allem für hohe Durchsatz.
Protocol
Representative Results
Discussion
In unseren Test haben wir als ALP Substrat pNPP verwendet. Dies ist eine funktionierende Lösung für ELISA und keine Verdünnung erforderlich. Nach Hydrolyse von ALP, ein gelbes Produkt entwickelt und kann gemessen werden, bei 405 nm. Am Ende der enzymatischen Reaktion wir kurz zentrifugiert, die 96-well-Platte und den Überstand auf eine frische 96-well-Platte zur Messung der Extinktion mit dem Platte Reader übertragen. Wir fanden, dass dieses zusätzliche Zentrifugationsschritt kritisch, da es die Konsistenz der Exti…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken William Rainey Harper College und der University of Illinois in Chicago für die Möglichkeit, diese Experimente durchzuführen. Wir danken auch McGraw-Hill-Stiftung für ihre großzügige Unterstützung.
Materials
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15g / L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose…………………………………. 2.50 Dipotassium phosphate………………2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
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