Dagelijkse fototherapie met rood licht te reguleren Candida albicans Biofilm groei
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de resultaten van de toepassing van het rood licht op de groei van Candida albicans biofilm. Een niet-coherente rood licht apparaat met de golflengte van 635 nm en dichtheid van de energie van 87.6 J·cm-2 werd toegepast in de groei van Candida albicans biofilms gedurende 48 uur.
Abstract
Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de resultaten van per dag rood licht behandeling op de groei van Candida albicans biofilm. Het vergroten van de planktonische groei van C. albicans SN425, groeide de inoculums op gist stikstof Base media. Voor de vorming van de biofilm, waren RPMI 1640 media, die hoge concentraties van aminozuren hebben toegepast om te helpen biofilm groei. Biofilms 48 uur twee keer per dag gedurende 1 min werden behandeld met een niet-coherente lichtapparatuur (rood licht; golflengte = 635 nm; energiedichtheid = 87.6 J·cm-2). Zoals een positieve controle (PC), 0,12% chloorhexidine (CHX) werd toegepast, en als een negatieve controle (NC), 0,89% NaCl werd toegepast op de biofilms. Kolonievormende eenheden (kve), droog gewicht, oplosbare en onoplosbare exopolysaccharides na behandelingen werden gekwantificeerd. Kort, het protocol hier gepresenteerd is eenvoudig, reproduceerbare en biedt antwoorden met betrekking tot de levensvatbaarheid, droog gewicht en extracellulaire polysaccharide bedragen na rood licht behandeling.
Introduction
De toename van diabetes, immunosuppressieve therapie toepassingen, HIV, AIDS-epidemie, invasieve klinische procedures en breedspectrum antibiotica verbruik in de afgelopen jaren gestegen de incidentie van Candida albicans gerelateerde ziekten1,2. C. albicans infecties zijn meestal gerelateerd aan biofilm ontwikkeling en Klinische manifestaties, zoals candidiasis of systemische weerslag, zoals candidemia1,2kunnen veroorzaken. Een van de opmerkelijkste virulentiefactoren van biofilm groei is de polysacharide extracellulaire matrix vestiging. Biofilm vorming samenwerkt om te verhogen van de weerstand tegen bestaande antifungale geneesmiddelen, milieudruk en host immuun mechanismen3.
De groei van de biofilm van C. albicans begint met de vroege hechting van planktonische cellen op een substraat, gevolgd door de verspreiding van gistcellen door middel van het oppervlak van het substraat, en hyphal groei. De laatste fase van de groei van de biofilm is de maturatie fase, waarin gist-achtige ontwikkeling wordt onderdrukt, de hyphal ontwikkeling breidt en de extracellulaire matrix omsluit de biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) in de matrix samen vormen de mannan-glucaan complexe5,6. De interactie van exopolysaccharides is van cruciaal belang voor de verdediging van de biofilms tegen drugs7. Vandaar, de vermindering van EPS uit de extracellulaire matrix van C. albicans kan ondersteunen de ontwikkeling van nieuwe antibiofilm protocollen voor orale candidiasis controle
Licht regelt de groei, de ontwikkeling en het gedrag van verschillende organismen8 en deze is vereffend als een antimicrobiële in Fotodynamische antimicrobiële chemotherapie (PACT). PACT is een zichtbaar licht van een specifieke golflengte en een licht absorberende fotosensitizer9van toepassing. De photosensitizers hebben echter problemen in de biofilm, doordringende veroorzaakt lagere werkzaamheid10. Het falen van therapeutische agenten om te infiltreren volledig biofilms is een reden dat biofilms, af en toe van zich verzetten tegen traditionele antimicrobiële therapie3,5. Deactiveren van de bijgevoegde Microbiële cellen, moeten antimicrobiële stoffen doordringen via de extracellulaire matrix; Toch is het EPS kenmerkt een diffusional obstakel voor dergelijke moleculen door te vragen hun niveau van vervoer in de biofilm of door het beïnvloeden van de reactie van de antimicrobiële met de matrix zelf11.
Gezien de nadelen van het PACT, het gebruik van licht vanzelf naar voren komt als een waardevolle verbetering. Voorlopige gegevens bleek dat de behandeling met blauw licht twee keer per dag de productie van EPS-onoplosbaar in Streptococcus mutans biofilm aanzienlijk geremd. Door de daling van de EPS-onoplosbaar, blauw licht verminderd biofilm groei. De resultaten van fototherapie rood licht met C. albicans biofilms zijn echter schaars. Vandaar, is het doel van dit onderzoek was om te evalueren in welke wijze fototherapie met behulp van rood licht de groei en de rangschikking van C. albicans biofilm beïnvloedt. Voor de behandeling tweemaal daags, aangepast we onze laboratory’s eerdere protocollen9,12 te bieden een gemakkelijk en reproduceerbaar biofilm model dat antwoorden met betrekking tot de levensvatbaarheid levert, droog gewicht en extracellulaire polysacchariden bedragen na rood licht behandeling. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt voor het testen van andere therapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen voor het succesvol kweken van C. albicans biofilm zijn: 1) om te doen de pre entmateriaal en het entmateriaal in YNB medium aangevuld met 100 mM glucose; 2) te wachten 90 min op de fase van de hechting en zorgvuldig was tweemaal de putjes met 0,89% NaCl voor het verwijderen van niet-naleving cellen; en 3) toe te voegen RPMI medium aan de zelfklevend cellen om te beginnen de vorming van de biofilm, aangezien RPMI schimmeldraden groei zal stimuleren. Aneuploidies kan optreden wanneer kw…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. Malvin N. Janal en Dr. Iriana Zanin voor de ontwikkeling van deze studie. We erkennen ook Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) voor het doneren van de spanning in dit onderzoek geanalyseerd.
Materials
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
Referenzen
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
- Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
- Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
- Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
- Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
- Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
- de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
- Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
- Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
- Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
- Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
- Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
- Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).
