针对中枢神经系统肿瘤的药物靶向是一项重大挑战。在这里, 我们描述了一个协议, 以产生一个体外模拟血脑肿瘤屏障使用小鼠和/或人类细胞, 并讨论其与中枢神经系统肿瘤靶向在体内的相关性。
血脑屏障 (BBB) 本质上具有高度选择性, 是生理条件下大脑稳态的关键。然而, 在脑肿瘤的背景下, BBB 的分子选择性也通过阻断外周管理的化疗的传递来保护肿瘤细胞。针对恶性脑瘤的新药 (包括纳米颗粒) 的开发, 理想的情况是需要使用临床前动物模型来研究药物的转染和抗肿瘤效果。为了符合3R 原理 (细化、减少和替换), 减少实验设置中实验室动物的数量, 并对大型抗肿瘤药物库进行高通量筛选, 我们开发了一种可在体外的人和使用内皮细胞、星形胶质细胞和患者衍生的胶质母细胞瘤球体的三层培养物模拟血脑肿瘤屏障 (BBTB)。为了提高可扩展性和重现性, 商业细胞系或不朽细胞已在量身定制的条件下使用, 以便形成类似于实际 BBB 的屏障。在这里, 我们描述了一个方案, 以获得 BBTB 模仿培养内皮细胞与星形胶质细胞在特定的细胞密度在插入物。例如, 这种 BBTB 模拟可用于通过内皮和星形胶质屏障的纳米颗粒通道的定量和共聚焦成像, 以及对同一检测方法中肿瘤细胞靶向的评价。此外, 我们还表明, 所获得的数据可以用来预测临床前动物模型中纳米粒子的行为。从更广泛的角度来看, 这种体外模型可以适应其他神经退行性疾病, 以确定新的治疗分子通过 BBB 和/或补充大脑有机体, 直接评估的疗效药物。
神经血管单元由神经元、星形胶质细胞和 BBB 组成, 由周细胞、星形胶质细胞、内皮细胞和形成大脑微血管的相关基底膜之间的复杂连接形成。这种紧密的细胞壁是由连续的、不形成的血管形成的, 可以很好地调节离子和分子 (包括激素、营养物质或药物) 的运动, 也可以调节循环细胞1的运动.通过高分子量分子 BBB (如治疗抗体、药物结合物或纳米化合物) 的低转 xos化极大地限制了包括恶性在内的神经系统疾病药物发现的进展。胶质瘤2。事实上, 口服或静脉注射的化疗药物到达大脑实质往往在不够低的浓度, 以诱发抗肿瘤作用, 或根本无法通过 BBTB 到达肿瘤细胞3。几项临床前和临床研究没有涉及 bbtb 渗透问题, 但试图暂时破坏 bbtb, 例如使用有重点的超声波4、5,或通过直接原位规避 bbtb。6.然而, 这些技术都无法抵消不可避免的肿瘤扩张或复发。因此, 在开发新型抗胶质瘤疗法时, 应将通过 BBTB 进行扩散视为成功提供治疗药物的关键方面之一.
由于 BBTB 内细胞相互作用的复杂性, 在研究分子从血液到大脑的过程中, 对实验动物进行体内研究似乎是显而易见的选择。然而, 在体内的大规模方法是相对复杂的建立, 因此, 不允许在合理的时间内, 以合理的成本, 对分子进行高通量筛选。更重要的是, 动物试验必须遵循3R 道德准则, 定义为 (i) 完善、(二) 减少, 并与目前情况相关, 三) 以替代议定书取代 (例如, 在 vitroin silico 方法中)。因此, 在体外重现 BBTB 似乎是一种有趣和有吸引力的可能性, 但它也构成了一项复杂的任务, 受到各种限制的挑战。许多试图用来自犬、猪、小鼠甚至人类起源的培养的原代细胞或细胞系重新建立这个复杂的隔间的文章已经出版 (rahman 等人8人和 helms 等人9人回顾了这一尝试)。这些模型包括三维微流体系统10、bbb 在芯片上 11、12和基于刀片系统中经典共培养的大量变种。然而, 目前的微流体和芯片系统要么不适合快速、高通量的药物验证研究13、14 , 要么目前与脑肿瘤药物输送研究不兼容。此外, 对155个已公布的模型使用原代细胞、诱导多能干细胞 (iPSC) 或商业细胞系的评价表明, 它们的测量和结论8存在研究间差异的趋势。这种实验室间重现性的缺乏可能与 (一) 非规范化培养条件有关, 例如细胞培养容器中的基底膜基质蛋白的可选涂层, ii) 亚培养和使用的增加含有血清的培养基, 包括细胞系15的遗传和表型修饰的主要驱动因素, 或 (iii) 在可重现的情况下, 在一道菜中再现了星形胶质和内皮成分之间的正确平衡。尽管使用永生细胞或商业细胞系建立体外 BBB 模型缺乏一些特性相比, 类似的模型, 只使用原代细胞, 我们表明, 正确的组合细胞显示非常可与其他参考模型16、17的已发表研究结果相比较。最终, 缺乏一个强大和可重复的模型来研究治疗化合物通过 BBTB 的通过脑肿瘤促使我们开发这里描述的方法。
由于我们的目标是利用该模型预测临床前动物模型中纳米粒子的体内传递, 我们首先利用含有与小鼠星形胶质细胞接触的含有小鼠内皮细胞的插入物来验证 BBTB 模型。除此之外, 我们还优化了模型, 以使用某些人体细胞系。一旦稳定, 细胞屏障被转移到培养与患者衍生的胶质母细胞瘤球体或商业胶质瘤细胞系。此后, 纳米颗粒的细胞化和肿瘤细胞靶向可以通过共聚焦显微镜观察, 并通过随着时间的推移采集样本进行量化。重要的是, 使用 BBTB 模拟物获得的结果可以可靠地预测纳米粒子在体内的行为, 支持在临床前验证之前使用 BBTB。
患者间肿瘤变异性概念的兴起, 使个性化癌症医学的研究重新焕发了活力。这种变异性也是中枢神经系统肿瘤的一个特征。由于肿瘤的不可预测性, 对化疗的反应增加了 BBB 对药物输送的庇护作用, 在病人护理中完全构成重大挑战.为了开发更有效的疗法, 通常需要筛选新分子的大库。为了评价新治疗靶点到达肿瘤部位的抗肿瘤效果和能力, 最好的选择是对体内植入小鼠患者化身的患者衍生细胞进行临床前研究。由于实际 (财政、时间、人力和设施资源) 和伦理原因 (使用实验动物时的3Rs 原则), 开发这样一个大规模的体内筛查平台往往是不可能的, 因此, 基于细胞的检测仍然是一个选择23的模型.选择已建立的细胞系和避免原代细胞的主要原因是为了促进可重复性和减少实验室动物的使用, 而实验室动物是分离和建立原生小鼠培养的主要来源。这里介绍的方法, 坚定地符合 3Rs, 可以有效地丢弃纳米颗粒从进一步的临床前调查的标准, 他们无法跨越模型 BBTB。作为一项原则证明, 我们在此描述了在 BBTB 开发和验证过程中获得的结果。我们能够在体内证实体外发现, 例如在测量376钠-荧光素的被动扩散时。
本文概述的协议描述了内皮细胞与星形胶质细胞共聚体形成血脑肿瘤样界面的准备工作。一旦这两种细胞类型之间的物理接触被建立, 内皮细胞层表现出与 BBB 的相似性 (例如, 紧密连接蛋白和相对较低的渗透率的细胞表面表达)。有趣的是, 模仿小鼠 BBTB 的研究似乎提供了与体内小鼠 BBB 渗透率测量24所获得的 Na-Fl 渗透率值特别相似的值.因此, BBTB 模拟的性能将与用来形成屏障的细胞的选择直接相关。BEND3 内皮细胞起源于大脑, 已知在与星形胶质细胞25形成障碍方面是成功的。然而, 我们一直在使用永生 HIFko 星形胶质细胞26生成 BBTB 模拟。由于缺乏低氧诱导因子, 这些星形胶质细胞不会产生 VEGF-A, 这在 BBTB 模拟稳定性中是典型的。星形胶质细胞已被确定为 BBB 通透性的调节剂, 例如通过释放 VEGF-A 以应对神经炎症27。血管内皮生长因子受体 (Vegfr) 的激活是体外28和体内29内皮细胞/血管通透性的关键调节剂.因此, VEGF-A 补充剂在培养基激活 VEGFR2 在内皮细胞上, 诱导磷酸化的粘附结蛋白, 如 ve-钙粘附在30。内皮细胞接触的丧失会产生高度渗透的血管。同样, 细胞培养检测中使用的胎儿牛血清的强有丝分裂特性和未知成分也会在屏障稳定和检测重现性方面引起重大问题。
人脐静脉内皮细胞 (Huvec) 有时被用于在体外形成 BBB 31;然而, 它们与大脑微血管内皮细胞 (如 Hcmece/d3 细胞系32) 在基因表达和障碍形成特性方面存在显著差异。然而, 与单独生长的 HuAR2T 细胞相比, 单独生长的 HuAR2T 细胞获得的渗透率相对较高, 通过将其与人类原发星胶质细胞结合, 大大降低了。虽然内皮细胞被要求形成细胞壁, 很明显, 星形胶质细胞具有同样重要的作用, 发挥 BBTB 形成和稳定。
当患者衍生的胶质瘤球体被添加到这个方程中时, 小鼠 BBTB 模仿重述了小鼠异种移植的一些特征, 如药物通过血管的扩散和肿瘤细胞靶向。例如, 当我们筛选出几种不同直径的纳米粒子时, 这里讨论的 BBTB 模拟成功地反映了体内的行为。为了说明体外模型和体内模型之间的相似性, 我们使用了前面描述的介孔硅酸盐纳米粒子33 , 它具有细胞穿透特性34与肿瘤靶向肽 coop 结合在他们的表面20。针对多肽的目的, 通过对侵入性肿瘤细胞的特异性结合, 与哺乳动物衍生的生长抑制剂 (MDGI) 结合。与正常组织35相比, 包括胶质瘤在内的几种癌症表达过度, 这使得 coop 成为一个非常有效的肿瘤靶向位, 能够增加有效载荷20的传递。这里使用的纳米颗粒以前已被证明扩散到大脑实质 (27547955), 当功能与紫杉醇功能化, 这些纳米货物已成功地减少胶质瘤生长在临床前模型36。在纳米颗粒表面添加聚乙二醇 (PEG) 残基也保持了其对正值 (约 + 4 mV) 的静态电荷, 从而与神经血管单元37有更好的相互作用, 并提高了它们的稳定性在流通。在所提供的数据中, PEG 的 3 kDa 与 Np110 结合在一起, 而 Np35v 被涂上 10 kDa 的 peg。然而, 分子量的聚乙二醇也导致纳米颗粒直径显著增加, 因此它们的物理能力跨越 BBB。因此, 我们检查了粒子的物理尺寸是否阻止了它们通过 BBTB, 以及这些观测是否可以在体内反映出来。
根据先前发表的观察, 我们观察到, Np110 在体外通过 BBTB 和携带颅内肿瘤的小鼠的 BBB 外渗, 而保留在 BBTB 的腔侧的 Np350 则模仿了 BBTB 的边缘和小 鼠。这些类似的结果强烈表明, BBTB 模型预测了纳米粒子在体内穿越 BBB 并到达大脑的能力。
BBB 细胞模型的相关性经常被讨论, 即使是对纳米粒子38的中央传递也是如此。我们在这里表明, 原代星形胶质细胞和内皮细胞, 都被认为是最相关的体外工具, 可以被不朽和/或市售细胞所取代, 确保更大的可扩展性和重现性。下一代的体外 bbb 仿制品可以通过结合微流体装置来开发, 允许形成精美的神经血管单位, 在结构上类似于实际的 bbb12,14。然而, 由于在交付的后续行动中存在技术限制, 这类模型目前不适合对传递给胶质瘤的分子进行高通量筛选14。确实很难捕捉到一道菜中 BBB 的生理复杂性, 而且 BBB 所表达的一些受体蛋白可能缺乏, 这可能会损害对结果的解释。另一个论点是, 体内和体外条件之间, 以及从一个细胞系到另一个细胞系, 特别是考虑内皮细胞, 基因表达的差异很大。然而, 也可以说, 神经血管单位不是大脑内的一个统一的实体39。生物学科学研究已经进入了一个人道的时代, 在设计实验之前, 总是考虑动物的福利、伦理责任和使用动物生命的成本。因此, 为了支持动物的替换, 最近越来越多的研究表明, 认识到模型的局限性, 并仔细选择细胞模型, 以建立障碍–重点是星形胶质细胞–需要在一道菜和动物模型40中获得的结果之间的匹配。通过这里描述的方法, 我们离减少用于筛选 BBB 转细胞增多以进行潜在治疗的实验动物数量又近了一步。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了芬兰癌症组织 Jane & Aatos Erkko 基金会和 Sirid Juselius 基金会 (至 p. l. 和 v. l. j.)、瑞士国家科学基金会 (高级博士后. 流动赠款: P300PB_164732, 给 S. 的赠款。)、Orion 研究基金会 (至 s. k.)、Maud Kuistila 纪念基金会 (至 s. k.) 和芬兰科学院 (TERRA, 2017年, 赠款: 314 498)。生物成像单元 (赫尔辛基) 因提供显微镜成像核心设施而获得认可。
Cells | |||
bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
Material and reagents | |||
100x17mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and – medium |
Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
Immunofluorescence | |||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
24 x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
DAPI | TOCRIS | 5748 | |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
Animal procedures | |||
10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
BD Microlance 25-gauge needles | Becton Dickinson | 300600 | |
Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL – Medical device class | |
Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
Equipment | |||
Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |