In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro
Summary
L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d’ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.
Abstract
L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans diverses voies de signalisation et est notamment impliquée dans la coordination de la fonction de chromatine et des processus associés à l’ADN. Cette modification implique une action séquentielle de plusieurs enzymes, y compris E1 ubiquiitin-activation, E2 ubiquiitin-conjugué et E3 ubiquiitin-ligase et est inversée par deubiquitinases (DUBs). L’ubiquitination induit la dégradation des protéines ou l’altération de la fonction protéique, y compris la modulation de l’activité enzymatique, l’interaction protéine-protéine et la localisation subcellulaire. Une étape critique dans la démonstration de l’ubiquitination ou de la déubiquitination des protéines est d’effectuer des réactions in vitro avec des composants purifiés. Les réactions efficaces d’ubiquitination et de deubiquitination pourraient être grandement affectées par les différents composants utilisés, les cofacteurs enzymatiques, les conditions tampons et la nature du substrat. Ici, nous fournissons des protocoles étape par étape pour effectuer des réactions d’ubiquitination et de déubiquitination. Nous illustrons ces réactions en utilisant des composants minimes de la souris Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, et RING1B, une ligase d’ubiquitine E3 qui monoubiquitinates histone H2A sur la lysine 119. La deubiquitination de H2A nucléosomal est exécutée utilisant un complexe minimal de Deubiquitinase répressif de Polycomb (PR-DUB) formé par le BAP1 deubiquitinase humain et le domaine d’ADaptor de DEUBiquitinase (DEUBAD) de son co-facteur ASXL2. Ces essais d’ubiquitination/deubiquitination peuvent être effectués dans le contexte des nucléosomes recombinants reconstitués avec des protéines bactéries purifiées ou des nucléosomes indigènes purifiés à partir de cellules de mammifères. Nous soulignons les subtilités qui peuvent avoir un impact significatif sur ces réactions et nous proposons que les principes généraux de ces protocoles puissent être rapidement adaptés à d’autres ligases et deubiquitinases ubiquitine e3.
Introduction
L’ubiquitination est l’une des modifications post-traductionnelles les plus conservées et est essentielle pour une grande variété d’organismes, y compris la levure, les plantes et les vertébrés. L’ubiquitination consiste en l’attachement covalent de l’ubiquitine, un polypeptide d’acide aminé hautement conservé 76, pour cibler les protéines et se produit en trois étapes séquentielles impliquant trois enzymes, c’est-à-dire E1-activation, E2-conjugué et E3 ligase1, 2,3. Cette modification post-traductionnelle joue un rôle central dans un large éventail de processus biologiques. En effet, les ligases E3, qui fournissent la spécificité de la réaction, constituent une grande superfamille d’enzymes et sont les enzymes les plus abondantes du système d’ubiquitine4,5,6. Les effets en aval de l’ubiquitination des protéines dépendent de la nature de la modification : monoubiquitination, multi-monoubiquitination et polyubiquitination linéaire ou ramifiée. La monoubiquitination est rarement associée à la dégradation protéasomal, mais au lieu de cela cette modification est impliquée dans la médiation de divers événements de signalisation. La polyubiquitination implique le N-terminal ou les résidus de lysine dans la molécule d’ubiquitine elle-même, et le destin d’une protéine polyubiquitinated dépend de quel résidu est impliqué dans l’extension de la chaîne d’ubiquitine. On sait depuis longtemps que la polyubiquitination médiée par la lysine 48 de l’ubiquitine induit une dégradation protéasomale. Au contraire, la polyubiquitination par lysine 63 de l’ubiquitine est souvent associée à l’activation des protéines7,8,9. Semblable à d’autres modifications post-traductionnelles importantes, l’ubiquitination est réversible et l’élimination de l’ubiquitine des protéines est assurée par des protéases spécifiques appelées deubiquitinases (DUB), qui ont émergé comme régulateurs importants des processus cellulaires 2 (en) , 10. Fait important, de nombreux DUB sont hautement spécialisés, et régulent, par la déubiquitination, des substrats spécifiques, ce qui indique qu’un équilibre fin entre l’ubiquitination et la deubiquitination est essentiel pour la fonction protéique. Les E3 et les DUB, ainsi que les machines de dégradation protéasome et les facteurs accessoires, forment le système de protéasome d’Ubiquitin (UPS, avec les gènes de ‘1200) qui règle les voies de signalisation principales, dont plusieurs sont associées à la croissance et à la prolifération cellulaires, détermination du destin cellulaire, différenciation, migration cellulaire et mort cellulaire. Fait important, la déréglementation de plusieurs cascades de signalisation impliquant l’ubiquitination favorise la tumorigénèse et les maladies de neurodégénérescence5,11,12,13, 14.
L’ubiquitination joue un rôle omniprésent dans la biologie de la chromatine et les processus dépendants de l’ADN15,16,17. Par exemple, la monoubiquitination de l’histone H2A sur la lysine 119 (ci-après H2A K119ub) est une modification post-traduction essentielle impliquée dans la répression transcriptionnelle et la réparation de l’ADN18,19,20, 21,22. H2A K119ub est catalysé par le Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), qui joue un rôle clé dans le maintien de l’information épigénétique et est fortement conservé de Drosophila à l’homme. Canonical PRC1 est constitué notamment par le RING1B et BMI1, qui sont le complexe de base E3 ubiquitin ligase responsable de l’événement d’ubiquitination mentionné ci-dessus22,23. Dans Drosophila, La monoubiquitination H2A (H2A K118ub qui correspond à H2A K119ub chez les mammifères) est inversée par le DUB Calypso, qui interagit avec Le Comb sexuel supplémentaire (ASX) formant le polycomb-répressif DUB (PR-DUB) complexe24. L’ortholog mammifère de calypso, BAP1, est un suppresseur de tumeur supprimé ou inactivé dans diverses malignités humaines25,26,27,28, 29 Ans et plus , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33. BAP1 régule les processus dépendants de l’ADN dans le noyau et l’apoptose à médiation calcique à l’endoplasmique33,34,35,36 ,36, 37 Ans, états-unis ( , 38 Annonces , 39 Ans et plus qu’ils , 40 ans, états-unis ( , 41 Ans, états-unis ( , 42. BAP1 assemble des complexes protéiques multi-subunit contenant des régulateurs de transcription notamment ASXL1, ASXL2 et ASXL3 (ASXLs), trois orthologues de l’ASX38,43. ASXLs utilisent le domaine DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), également appelé domaine ASXM, pour stimuler l’activité BAP1 DUB35,36,44. Par conséquent, ASXLs jouent des rôles importants en coordonnant l’activité DEB DEB de BAP1 à la chromatine et plus largement sa fonction de suppresseur de tumeur.
Plusieurs méthodes existent pour étudier les processus d’ubiquitination et de déubiquitination. Notamment, les essais biochimiques utilisant des protéines purifiées des bactéries restent très puissants en démontrant l’ubiquitination directe de, ou l’élimination de l’ubiquiitin de, substrats spécifiques. Ces expériences peuvent être menées pour étudier une gamme de paramètres tels que la détermination de l’exigence de complexes minimaux, la détermination des réactions cinétiques, la définition des relations structure/fonction, et la compréhension de l’impact des pathologies mutations génétiques. Ici, nous fournissons des protocoles pour mener des réactions d’ubiquitination et de deubiquitination sur des substrats de chromatine avec des composants purifiés. En tant que système modèle, l’ubiquitination in vitro et la deubiquitination de la protéine nucléosomale H2A sont présentées. Les protéines purifiées par les bactéries assemblées dans des complexes minimaux de RING1B/BMI1 et BAP1/DEUBAD sont utilisées respectivement pour l’ubiquitination ou la déubiquitination du H2A nucléosomal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs avantages d’établir l’ubiquitination in vitro robuste et les essais de deubiquitination pour des protéines d’intérêt. Ces essais peuvent être utilisés pour : (i) établir des conditions optimales et définir l’exigence minimale pour ces réactions, (ii) déterminer les constantes cinétiques et biochimiques enzymatiques, (iii) définir les rôles des cofacteurs ou des inhibiteurs qui peuvent avoir un impact sur ces réactions, (iv) identifier les interfaces d’interaction, (v) tester l’impact des mu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Diana Adjaoud pour son assistance technique. Ces travaux ont été appuyés par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (2015-2020), de Génome Québec (2016-2019) et de Génome Canada (2016-2019) à E.B.A. E.B.A. est chercheur principal au Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L.M et N.S.K. ont une bourse de doctorat du FRQ-S. H.B a obtenu une bourse de doctorat du Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique de Tunisie et de la Fondation Cole.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
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