Неинвазивные стратегии хронического манипулирования контролируемой DREADD нейронной активностью
Summary
Здесь мы описываем два неинвазивных метода хронического контроля нейронной активности с использованием хемогенетики у мышей. Глазные капли были использованы для доставки клозапин-N-оксид (CNO) ежедневно. Мы также описываем два метода длительного введения CNO в питьевой воде. Эти стратегии хронического контроля нейронов требуют минимального вмешательства, снижая стресс животных.
Abstract
Химиогенетические стратегии стали надежными инструментами дистанционного управления нейронной активностью. Среди них дизайнерские рецепторы, активизируемые исключительно дизайнерскими препаратами (DREADDs), стали самым популярным хемогенетическим подходом, используемым в современной неврологии. Большинство исследований доставить лиганд клозапин-N-оксид (CNO) с помощью одной интраперитонеальной инъекции, которая подходит для острого активации / ингибирования целевой нейронной популяции. Есть, однако, лишь несколько примеров стратегий для хронической модуляции DREADD контролируемых нейронов, большинство из которых полагаются на использование систем доставки, которые требуют хирургического вмешательства. Здесь мы расширяем две неинвазивные стратегии для доставки лиганда CNO для хронического манипулирования нейронной популяции у мышей. CNO вводили либо с помощью повторяющихся (ежедневных) глазных капель, или хронически через питьевую воду животного. Эти неинвазивные парадигмы приводят к надежной активации дизайнерских рецепторов, которые сохранялись на протяжении всего лечения CNO. Методы, описанные здесь предлагают альтернативы для хронического DREADD-опосредованного контроля нейронной активности и могут быть полезны для экспериментов, направленных на оценку поведения в свободно движущихся животных, уделяя особое внимание менее инвазивных методов доставки CNO.
Introduction
Технические достижения в области нейробиологии позволили ученым точно выявлять иконтролировать активность определенных нейронных популяций 1. Это способствовало лучшепонять основы нейрональных цепей и их влияние на поведение животных, а также, пересмотр установленных догм2,3. Среди этих новых инструментов, оптогенетические и химиогенетические стратегии оказали глубокое влияние не только на качество открытий, но и на то, как эксперименты задуманы и разработаны4. В настоящей рукописи мы сосредоточиваемся на химиогенетических стратегиях контроля активации нейронов с помощью инженерных стратегий рецептор-лиганд. Дизайнерские рецепторы, активируемые исключительно дизайнерскими препаратами (DREADDs), представляют собой один из самых популярных химиогенетических инструментов для дистанционного управления нейронной активностью, как было рассмотрено Roth 20165. DREADDs использовать модифицированные мускариновых рецепторов ацетилхолина, которые специально активируются инертным лиганд, клозапин-N-оксид (CNO)6.
Большинство исследований используют CNO в ведении интраперитонеальных (т.п.) инъекций, который эффективно контролирует дозировку и сроки активации инженерных рецепторов в острой моды. Однако, когда требуется повторяющаяся или хроническая активация DREADD, использование нескольких инъекций i.p. становится неосуществимым. Для решения этой проблемы, различные стратегии для хронической доставки CNO были зарегистрированы, в том числе имплантированных minipumps7 и внутричерепных канюлев8,9. В разной степени, все эти стратегии вызывают у животных стресс и боль10, и требуют хирургического вмешательства, которые также могут иметь прямое влияние на поведенческие реакции, которые будут проверены11. Здесь мы описываем три неинвазивные стратегии для хронической доставки CNO.
Для этой цели мышам были стереотаксисически введены в гиппокампе с адено-ассоциированным вирусом (AAV), кодирующим сконструированную версию возбуждающего мускарина M3 (hM3Dq), что при активации лиганд CNO приводит к взрыву, как стрельба нейроны6. Ранее было показано, что одна капля глаз, содержащая CNO может эффективно вызвать надежную активацию DREADD-выражения нейронов12. Здесь мы описываем модифицированный метод для повторяющейся доставки глазных капель. Для достижения хронического и устойчивого контроля над рецепторами дизайнера, мы затем описать неинвазивную стратегию для доставки CNO для мышей через питьевую воду. Наконец, мы описываем альтернативную парадигму для доставки CNO в питьевой воде во время ограниченного временного окна. Мышей локомоторной деятельности, а также питьевой поведение и потребление сладких калорий решений, в основном ограничивается темной части света / темного цикла13,14. Поэтому мы приняли протокол, основанный на предпочтении мыши сахарозе. Путем измерять индукцию немедленно-раннего гена c-Fos в AAV-инфицированных клетках, как считывание для активации нейронов12,15, мы нашли что эти стратегии поставки CNO надежно активируют DREADD-контролируемые невенциальны над выдвинутыми Длительности.
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADDs стали популярным и эффективным подходом к удаленному манипулированию нейронной активностью17. Разработка альтернативных стратегий для доставки СНО в целом увеличит спектр вариантов, доступных для конкретных экспериментальных настроек. Кроме того, неинвазивные стра?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана программой интрамуральных исследований в Национальном институте психического здоровья (ЗИА MH002964-02). Мы хотели бы поблагодарить поддержку NIMH IRP грызунов поведенческого ядра (IC MH002952).
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
Referenzen
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. . Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neurowissenschaften. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
