Una strategia convergente per la generazione di una libreria cDNA virtualmente in sequenza da ostriche del Pacifico senza riferimenti
Summary
Descriviamo una strategia su come usare campioni di RNA da campioni di ostriche del Pacifico senza riferimenti e valutiamo il materiale genetico confrontandosi con i dati del genoma pubblicamente disponibili per generare una libreria cDNA virtualmente sequenziata.
Abstract
L’accesso al materiale biologico delle specie di riferimento, che sono stati utilizzati in precedenza in esperimenti chiave come lo sviluppo di nuove linee cellulari o progetti di sequenziamento del genoma, sono spesso difficili da fornire per ulteriori studi o terzi a causa della natura consumiva dei campioni. Anche se ora ampiamente distribuiti sulle coste del Pacifico in Asia, Australia e Nord America, i singoli esemplari di ostriche del Pacifico sono geneticamente molto diversi e quindi non sono direttamente adatti come materiale di partenza per le librerie genetiche. In questo articolo, dimostriamo l’uso di campioni di ostriche del Pacifico senza riferimenti ottenuti dai mercati ittici regionali per generare librerie di cDNA. Queste librerie sono state poi confrontate con il genoma delle ostriche pubblicamente disponibili, e la libreria correlata più vicina è stata selezionata utilizzando i geni di riferimento mitocondriali Cytochrome C Oxidase I (COX1) e NADH Dehydrogenase (ND). L’idoneità della libreria cDNA generata è dimostrata anche dalla clonazione e dall’espressione di due geni che codificano gli enzimi UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) e UDP-xylose synthase (UXS), che sono responsabili della biosintesi di UDP-xylose da UDP-glucosio.
Introduction
L’acquisizione di materiale biologico di riferimento per la vita può essere difficile a causa dei lunghi tempi di consegna, del ragionamento imprenditoriale o delle norme doganali specifiche per paese. In alternativa, il materiale biologico richiesto può essere raccolto anche da campioni fenotipicamente identici. Tuttavia, questi campioni possono variare in modo significativo a livello del genotipo, e quindi i confronti con genomi di riferimento memorizzati digitalmente della stessa specie sono spesso resi difficili o addirittura inutili a causa dell’incompatibilità del materiale appena ricavato con metodi di amplificazione del DNA esistenti. Il sequenziamento dei geni altamente conservati di singoli campioni è uno strumento ampiamente utilizzato e potente per identificare le specie1, come i geni mitocondriali conservati che vengono spesso utilizzati come geni di riferimento per la valutazione della qualità delle librerie cDNA2 ,3,4,5,6. La logica alla base del metodo qui presentato è che l’alta conservazione delle sequenze geniche mitocondriali nei singoli campioni anonimi di ostriche rispetto alle corrispondenti sequenze del genoma di riferimento indica che altri geni possono anche basso livello di divergenza, dato il tasso generalmente più veloce di evoluzione del DNA mitocondriale rispetto al DNA nucleare7, consentendo l’amplificazione e l’isolamento di un’ampia gamma di geni scientificamente e industrialmente rilevanti semplicemente utilizzando semplicemente pubblicamente dati di sequenziamento disponibili come riferimento.
L’obiettivo generale del metodo qui descritto è quello di presentare un flusso di lavoro ottimizzato per generare una libreria cDNA di ostriche virtualmente sequenziata che può essere utilizzata come DNA modello per la clonazione dei geni delle ostriche. Nel sequenziamento virtuale, il sequenziamento del genoma de novo è elusivo; invece, una sequenza di riferimento nota, memorizzata digitalmente viene utilizzata direttamente per utilizzare o progettare primer per la produzione di cDNA che alla fine comprenderanno una libreria (o essere aggiunti a uno preesistente). L’obiettivo è quello di produrre una libreria cDNA convergente, il che significa che le somiglianze tra le sequenze cDNA generate e la sequenza di riferimento possono essere classificate da bassa ad alta divergenza. Un vantaggio chiave dell’uso della sottounità 1 (COX1) e della dehydrogenassi NADH (ND) del citocro c’ come geni di riferimento è che anche gli esemplari di ostriche altamente geograficamente disgiunti possono essere profilati a causa dell’elevata conservazione di questi geni mitocondriali. Dopo aver dimostrato l’approccio con questi marcatori ben consolidati, dimostriamo quindi la sua applicazione a due candidati enzimatici che sono coinvolti nella biosintesi dei nucleotidi zuccherini e possono essere di rilevanza industriale8,9, 10. Il potenziale biotecnologico dell’ostrica del Pacifico è ancora inesplorato. Pertanto, riteniamo che questo metodo convergente per la preparazione di una libreria cDNA virtualmente in sequenza sarà appropriato anche per i ricercatori non specializzati che vogliono generare cDNA da questo materiale biologico pertinente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato consente l’identificazione genetica di campioni di ostriche senza riferimenti con fenotipo simile provenienti dai mercati ittici regionali confrontando i geni COX1 e ND con un database del genoma del DNA delle ostriche disponibile al pubblico. Il significato di questo metodo sta nella sua semplicità, in quanto è necessaria una sola reazione PCR per la valutazione della libreria cDNA virtuale. I due geni coX1 e ND mitocondriali conservati sono stati amplificati da una libreria cDNA che è stata …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 31471703, A0201300537 e 31671854 a J.V. e L.L., numero di sovvenzione 31470435 a G.Y.), e il 100 Foreign Talents Plan (numero di sovvenzione JSB2014012 a J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
Referenzen
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