Isolement et évaluation quantitative des cellules de brosse de La souris trachée
Summary
Les cellules de brosse sont les cellules épithéliales chimiosensorielles cholinergiques rares trouvées dans la trachée naïve de souris. En raison de leur nombre limité, l’évaluation ex vivo de leur rôle fonctionnel dans l’immunité de voie aérienne et le remodelage est provocante. Nous décrivons une méthode pour l’isolement des cellules trachéales de brosse par cytométrie de flux.
Abstract
Les cellules trachéales de brosse sont des cellules épithéliales chimiosensorielles cholinergiques prêtes à transmettre des signaux du lumen de voie aérienne au système immunitaire et nerveux. Ils font partie d’une famille de cellules épithéliales chimiosensorielles qui comprennent des cellules tuft dans la muqueuse intestinale, des cellules de brosse dans la trachée, et des cellules chimiosensorielles et microvilleuses solitaires dans la muqueuse nasale. Les cellules chimiosensorielles dans différents compartiments épithélial partagent des marqueurs intracellulaires clés et une signature transcriptionnelle de noyau, mais montrent également l’hétérogénéité transcriptionnelle significative, reflétant probablement l’environnement local de tissu. L’isolement des cellules trachéales de brosse des suspensions simples de cellules est exigé pour définir la fonction de ces cellules épithéliales rares en détail, mais leur isolement est provocant, potentiellement dû à l’interaction étroite entre des cellules trachéales de brosse et des terminaisons nerveuses ou en raison de la composition spécifique aux voies aériennes des jonctions serrées et adhérentes. Ici, nous décrivons une procédure pour l’isolement des cellules de brosse de l’épithélium trachéal de souris. La méthode est basée sur une séparation initiale de l’épithélium trachéal de la submucosa, permettant une incubation plus courte ultérieure de la feuille épithéliale avec du papain. Cette procédure offre une solution rapide et pratique pour le tri cytométrique de flux et l’analyse fonctionnelle des cellules viables de brosse trachéale.
Introduction
Les cellules de brosse appartiennent à une classe de cellules épithéliales chimiosensorielles caractérisées par l’expression des récepteurs amers de goût et des machines de transduction de récepteur de goût trouvées dans les cellules de papetor de goût. Contrairement aux cellules des bourgeons gustatifs, les cellules épithéliales chimiosensorielles sont dispersées dans des surfaces épithéliales et sont appelées cellules chimiosensorielles solitaires (SCC) et cellules microvilleuses dans l’épithélium nasal1,2, cellules de brosse dans la trachée 3,4, et les cellules de touffe dans l’intestin5,6. Les cellules épithéliales exprimant les récepteurs amers de goût et les machines de transduction de goût amer se trouvent également dans l’urètre7,8 et le tube auditif9. Les cellules de brosse de voie aérienne ont des fonctions uniques dans les réponses neurogènes et immunisées de voie aérienne. Ce sont des cellules chimiosensorielles productrices d’acétylcholine qui évoquent des réflexes respiratoires protecteurs lors de l’activation avec des composés amers et des métabolites bactériens comme les substances de détection de quorum10. Les cellules de brosse de voie aérienne sont également la source épithéliale dominante de voie aérienne deLIL-25, qui règle l’inflammation de type 2 aéroallergen-obtenue dans les voies respiratoires 3.
La caractérisation de la transcriptome complète des cellules inférieures de brosse de voie aérienne et de leur réponse aux stimulus environnementaux a été limitée par leurs nombres bas dans l’épithélium trachéal et nombre très limité au-delà des grandes bronches10. Les techniques utilisées pour l’isolement des cellules chimiosensorielles de l’épithélium intestinal n’ont pas donné des nombres proportionnellement élevés de la trachée, peut-être en raison des contacts intimes des cellules trachéales de brosse avec des terminaisons nerveuses10 ou autre facteurs spécifiques aux tissus dans la muqueuse respiratoire, comme la composition des adhérents et des protéines de jonction serrées. Les rapports récents de l’isolement réussi des cellules trachéales de brosse dans des nombres plus élevés pour l’analyse de séquençage d’ARN simple de cellules ont employé une incubation de 2 h avec le papain ou une incubation de 18 h avec pronase11,12. Puisque de plus longues incubations avec des enzymes digestives peuvent diminuer la viabilité de cellules et modifier le profil transcriptionnel des cellules des tissus digérés13,ceci pourrait biaiser l’analyse comparative avec d’autres populations épithéliales chimiosensorielles.
Ici, nous rapportons une méthode pour l’isolementdes cellules trachéales de brosse pour le séquençage d’ARN 3. Le traitement de la trachée avec le dispase de haut-dose sépare l’épithélium du submucosa. La digestion ultérieure de la feuille épithéliale avec la papaine permet une excellente récupération de cette cellule structurelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons constaté qu’une combinaison du traitement de dispase de haut-dose pendant 40 min suivi d’un traitement court de papain (30 min) fournit un protocole optimal pour la digestion trachéale et l’isolement de cellules de brosse. Cette combinaison évite la digestion étendue et produit le rendement le plus élevé des cellules de brosse, comparéaux aux protocoles alternatifs.
Tandis que la digestion de poumon pour extraire les cellules hématopoïétiques a classiquement compté sur le…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Adam Chicoine au Brigham and Women’s Human Immunology Center Flow Core pour son aide au tri cytométrique du débit. Ce travail a été soutenu par National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), et K08 AI132723 (L.G.B), et par l’American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), par le Prix de perfectionnement des facultés de la Fondation AAAAI (L.G.B.), par le Prix Steven et Judy Kaye des jeunes innovateurs (N.A.B.), par le Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.), et par un don généreux de la famille Vinik (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
Referenzen
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