포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학
Summary
배양 된 일차 또는 확립 된 세포 주는 일반적으로 동물 모델을 사용 하기 전에 초기 접근법으로 서 근본적인 생물학적 및 기계적 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 아연 (Zn) 및 원자 흡 광도 분광학이 있는 다른 미 량 원소 연구를 위해 전체 세포 추출 물과 세포 분 획을 준비 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
전이 금속은 유기 체에 필수적인 미 량 영양소 이지만 단백질의 생리 금속과 경쟁 하 고 산화 환 원 스트레스를 발생 시켜 높은 농도로 세포에 독성이 있을 수 있습니다. 금속 고갈 또는 축적으로 이끌어 내는 병리학 적 상태는 다른 인간적 인 질병의 인과 대리인입니다. 몇몇 예는 빈혈증, acrodermatitis enteropathica, 및 윌슨의 그리고 Menkes의 질병을 포함 합니다. 따라서 이러한 요소가 정상적인 생리 적 기능에 기여 하는 방법을 탐구 하는 연구를 용이 하 게 하기 위해 높은 민감도와 정확성을 가진 생물학적 시료에서 전이 금속의 수준과 수송을 측정 할 수 있어야 하는 것이 중요 합니다 독성. 아연 (Zn)은 예를 들어 많은 포유류 단백질의 보조 인자이 고, 신호 전달에 관여 하며, 세포에서의 이차 메신저 이다. 과잉에서, Zn은 독성이 며 다른 금속의 흡수를 억제할 수 있으며, 적자 상태에서는 잠재적으로 치명적인 다양 한 조건으로 이어질 수 있습니다.
흑연로 원자 흡수 분 광 법 (GF-AAS)은 다양 한 생물학적 샘플에서 Zn 및 기타 전이 금속 농도를 결정 하는 매우 민감하고 효과적인 방법을 제공 합니다. GF-AAS를 통한 전기 열 분무는 관심 요소의 여기 파장을 사용 하 여 후속 선택적 흡수 분석을 위해 소량의 시료를 분무 하 여 금속을 정량 합니다. 맥주-램버트 법칙의 선형성의 한계 내에서, 금속에의 한 빛의 흡 광도는 분석 물의 농도에 정비례 합니다. Zn 함량을 결정 하는 다른 방법에 비해, GF-AAS는 작은 샘플 용적에서 고감도의 작은 세포내 분자와 단백질의 무료 및 복합 Zn을 모두 검출 합니다. 또한, GF-AAS는 유도 결합 플라즈마 질량 분 광 법 (ICP) 또는 싱크 로트 론 기반 X 선 형광 보다 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 이 방법에서는, GF-AAS에서 분석을 위해 상이한 배양 된 세포 주 들의 체계적인 샘플 준비가 기재 되어 있다. 이 미 량 원소의 변이는 전체 세포 용 해물과 증식 및 분화 된 세포의 소 세포 분 획을 원리의 증거로 서 비교 하였다.
Introduction
아연, Cu, Mn 및 Fe와 같은 전이 및 중 금속은 식품 및 오염 물질의 두 영양소 모두에서 자연적으로 발견 됩니다. 모든 살아있는 유기 체는이 미 량 영양소의 다른 양을 요구 합니다; 그러나, 높은 수준에 노출은 유기 체에 해로운. 금속 수집은 주로 다이어트를 통해, 하지만 금속은 또한 피부를 통해 흡입 또는 흡수 될 수 있다1,2,4,5. 대기 입자에 있는 금속의 존재가 증가 하 고 건강 위험과 크게 연관 되어 있다는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다. 인위적인 활동으로 인하여 Ag와 같은 중 금속의 증가 된 수준, 예컨대 Cd, Cr, Hg, Ni, Fe 및 Pb는 대기 미 립 자 물질, 빗 물 및 토양6에서 검출 되었다. 이러한 금속은 필수 생리 적 미 량 원소, 특히 Zn과 Fe와 경쟁할 가능성이 있으며 생물학적 과정에 대 한 기본 효소를 비활성화 하 여 독성 효과를 유발 합니다.
미 량 원소 Zn은 산화 환 원 중성 이며, 포유류 단백질8,9의 10% 이상에서 단백질 폴딩 및 촉매 활성에 필요한 근본적인 보조 인자를 만드는 생물학적 반응에서 루이스 산으로 서 동작 하며, 10; 따라서 다양 한 생리 기능8,11에 필수적입니다. 그러나, 많은 미 량 원소 처럼, 정상적인 생리 기능을 촉진 하 고 독성을 일으키는 이러한 금속 사이의 섬세 한 균형이 있다. 포유류에서, Zn 결핍은 빈 혈, 성장 지연, hypogonadism, 피부 이상, 설사, 탈모 증, 맛 장애, 만성 염증 및 장애인 면역 및 신경 기능 장애를 야기 한다11,12, 16,17,18. 과량으로, Zn은 세포 독성을 가지 며 구리19,20,21등의 다른 필수 금속의 흡수를 저해 한다.
추가적으로, Cu와 Fe와 같은 몇몇 금속은 유해한 반응에 참여할 가능성이 있습니다. 펜 톤 화학을 통한 반응성 산소 종 (ROS)의 생산은 철 황 클러스터 단백질의 조립을 방해 하 고 지질 대사22,23을변경할 수 있습니다. 이 손상을 방지 하기 위해, 세포는 독성 효과를 방지 하기 위해 금속 결합 샤 페론 및 전송기를 활용 합니다. 의심 할 여 지 없이, 금속 항상성 특정 세포 유형이 금속의 적절 한 수준을 유지 하기 위해 엄격 하 게 제어 해야 합니다. 이러한 이유로 생물학적 시료에서 미 량 금속을 정확 하 게 측정 하기 위한 기술을 발전시키는 데는 상당한 필요성이 있습니다. 발달 하 고 성숙한 유기 체에서 세포 수준, 다른 발달 단계 및 정상 및 병리학 적 조건에서 미 량 원소에 대 한 차등 생물학적 필요성이 존재 합니다. 따라서, 조직 및 전신 금속 레벨의 정밀한 결정은 organismal 금속 항상성 이해에 필요 하다.
흑연로 원자 흡수 분 광 법 (GF-AAS)은 작은 시료 부피에 사용 되는 고감도 기술로 서 생물학적 및 환경적 시료에 존재 하는 전이 및 중 금속을 측정 하는 데 이상적입니다25,26 , 28 , 28. 또한, 기술의 높은 감도로 인해 xenopus 를 사용 하 여 Na +/k+ATPase 및 위 H+/k+-ATPase의 미세한 수송 특성을 연구 하는 데적합 한 것으로 나타났습니다. 모델 시스템으로 서 난 모 세포 (29). GF-AAS에서, 샘플 내의 원자화 된 요소는 관심 있는 금속을 포함 하는 광원에 의해 방출 되는 방사선의 파장을 흡수 하 고, 흡수 된 방사선은 원소의 농도에 비례 합니다. 원소 전자 여기는 각 화학 원소에 대 한 고유 양자화 된 과정에서 자외선 또는 가시 방사선의 흡수에 일어난다. 단일 전자 공정에서, 광자의 흡수는 원자 내에서 더 낮은 에너지 레벨로 이동 하는 전자와 GF-AAS는 샘플에 의해 흡수 되는 광자의 양을 결정 하며,이는 방사선 흡수의 수에 비례 한다 요소는 흑연 튜브에서 원자화.
이 기법의 선택 성은 각 원소에 특정 흡수/방출 스펙트럼 라인이 있는 원자의 전자 구조에 의존 합니다. Zn의 경우, 흡 광도 파장은 213.9 nm이 고, 다른 금속과 정밀 하 게 구별할 수 있다. 전반적으로 GF-AAS는 적절 한 검출 한계 (LOD)와 고감도 및 선택성25를 사용 하 여 Zn을 정량화 하는 데 사용할 수 있습니다. 흡수 된 파장의 변화는 통합 되 고 특정 및 절연 파장에서 에너지 흡수의 피크로 제시 됩니다. 주어진 샘플에서 Zn의 농도는 일반적으로 맥주-램버트 법칙에 따라 알려진 농도의 표준 곡선에서 계산 되며, 여기서 흡 광도는 샘플의 Zn 농도에 정비례 합니다. 그러나 GF-AAS 분석에 맥주 램버트 방정식을 적용 하면 약간의 합병증도 나타납니다. 예를 들어, 샘플의 분무 및/또는 불균일 한 농도의 변동은 금속 측정에 영향을 줄 수 있습니다.
GF AAS 미 량 원소 분석에 필요한 금속 분무는 세 가지 기본 단계로 구성 됩니다. 첫 번째 단계는 액체 용 매가 증발 되는 탈 용 매입니다. 퍼니스 후 건조 화합물을 떠나는 것은 약 100 ° c의 온도에 도달 한다. 이어서, 화합물을 800 내지 1400 ° c에서가 열 하 여 기화 시켜 (분석 하고자 하는 원소에 따라) 기체가 된다. 마지막으로, 기체 상태의 화합물은 1500에서 2500 ° c 까지의 온도 범위에서 원자화 됩니다. 상기 논의 된 바와 같이, 관심 금속의 농도 증가는 GF-AAS에 의해 검출 된 흡수에 비례 증가를 렌더링 하지만, 퍼니스는 분석의 동적 범위를 감소 시킬 수 있는 농도의 작동 범위 기기에 의해 결정 됩니다. 따라서,이 기술은 낮은 농도를 요구 하 고 비어 있는 램버트 법칙의 LOD 및 선형성의 한계를 결정 함으로써 방법의 동적 범위에 대 한 신중한 결정을 필요로 한다. LOD는 물질을 검출할 때 필요한 최소 수량으로, 매트릭스에서 Zn의 표준 편차를 3 배로 정의 합니다. LOL은 맥주 램버트 법을 사용 하 여 검출 될 수 있는 최대 농도 이다.
이 작업에서는 전체 세포 추출 물, 세포질 및 핵 분 획 및 증식 및 분화 배양 세포에서 Zn의 수준을 분석 하는 표준 방법을 설명 합니다 (그림 1). 우리는 샘플 준비 중 금속 손실을 방지 하기 위해 다른 세포 시스템에 핵 프로토콜의 급속 한 격리를 조정 했습니다. 사용 된 셀룰러 모델은 마우스 위성 세포, 뮤 린 신경 모 세포종 세포 (N2A 또는 Neuro2A), 뮤 린 3T3 L1 지방 세포내, 인간 비 종양 유 방 상피 세포 주 (MCF10A) 및 상피 마 딘-다 비 개 신장 ( MDCK) 셀입니다. 이 세포는 다른 계보에서 설립 된 및 시험관에서금속 수준의 계보 특정 변화를 조사 하기 위한 좋은 모델.
마우스 위성 세포에서 유래 된 1 차 myoblasts은 골격 근육 분화를 조사 하기에 적합 한 시험관 내 모델을 구성 합니다. 이러한 세포의 증식은 높은 혈 청 조건 하에서 배양 할 때 빠르다. 근육 혈통으로의 분화는 저 혈 청 조건30에 의해 유도 된다. 뮤 린 신경 모 세포종 (N2A) 확립 된 세포 주는 마우스 뉴 럴 크레스트 로부터 유래 되었다. 이들 세포는 뉴런 및 아메바 줄기 세포 형태학을 제시 한다. 분화 자극 시, N2A 세포는 신경 필 라 멘 트와 같은 뉴런의 여러 성질을 제시 한다. N2A 세포는 알츠하이머병을 조사 하기 위해 사용 되는, 신경 근 성장, 및 신경 독성31,32,33. 3T3-L1 뮤 린 전 지방 세포는 지질 생성과 관련 된 대사 및 생리 적 변화를 조사 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 이들 세포는 섬유 아 세포 유사 형태학을 제시 하지만, 일단 분화에 자극을 주며, 지질 합성과 중성 지방 축적과 관련 된 효소 활성화를 제시 한다. 이는 세포질 지질 방울34,35을 생성 하기 위한 형태학 적 변화로 관찰 될 수 있다. MCF10A는 유 방 섬유 낭 성 질환36을 가진 폐 경전 여성에서 유래한 비 종양 유 방 상피 세포 라인 이다. 이는 증식, 세포 이동 및 침략과 같은 유 방 발암 물질과 관련 된 생화학 적, 분자 및 세포 연구에 널리 사용 되 고 있습니다. 마 딘-다가 개 신장 (MDCK) 상피 세포 주는 광범위 하 게 사용 되어 상피 표현 형의 확립과 관련 된 특성 및 분자 사건을 조사 한다. 합류에 도달 하면,이 세포는 편광 되 고 세포 세포 유착을 확립, 포유류 상피 조직의 특성37.
포유동물 세포에서의 Zn 수준을 측정 하는 AAS의 능력을 시험 하기 위해, 우리는 이들 5 개의 세포 주 들의 전체 및 세포 분 획 (사이토 졸 및 핵)을 분석 하였다. AAS 측정은 이러한 세포 유형에 서 Zn의 상이한 농도를 보여주었다. 농도는 4 개의 확립 된 세포 주 (단백질의 20에서 40 nmol/mg에 이르기까지)에서 증가 하 고 1 차적인 myob(4~7nmol/mg 단백질)의 분화에서 더 낮다. 아연 수준에서 작은 비 중요 한 증가는 세포 증식에 비교 될 때 일차 myoblasts 및 신경 모 세포종 세포를 차별화에서 검출 되었다. 분화 된 지방 세포에서 반대 효과가 검출 되었다. 그러나 3T3-L1 세포 증식은 분화 된 세포에 비해 금속의 높은 농도를 나타내 었 다. 중요 하 게도, 이러한 3 개의 세포 주에서, 세포 분별은 Zn이 이들 세포의 대사 상태에 따라 사이토 졸 및 핵에 차별적으로 분포 되어 있음을 보여주었다. 예를 들어, 증식에 있어서, N2A 세포 및 3T3-L1 사전 지방 세포, 금속의 대다수는 핵에 국한 된다. 특정 세포 처리를 사용 하 여 분화의 유도 시, 아연은이 세 가지 세포 유형에 서 사이토 졸에 국한. 흥미롭게도, 둘 다 상피 세포 라인은 특성 꽉 단층 형성 된 합류에 도달 했을 때에 비해 증식 시 Zn의 높은 수준을 보였다. 상피 세포 증식에서, 유 방 세포 주는 사이토 졸과 핵 사이에 동등한 Zn 분포를 MCF10A, 신장 유래 세포 주는 대부분의 금속이 핵에 위치 하였다. 이 두 세포 유형에 서, 세포가 합류에 도달 하면, Zn은 주로 사이토 졸에 위치 하였다. 이러한 결과는 GF-AAS가 저 수율 샘플에서 원소 분석을 수행 하기 위한 매우 민감하고 정확한 기술 이라는 것을 보여줍니다. GF-AAS는 세포 분 획과 결합 하 고 다른 세포 주 및 조직에서 미 량 금속 원소의 레벨을 조사 하도록 조정할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
원자 흡 광도 분광학은 소량의/대량 생물학 견본에 있는 Zn 정량화를 위한 높게 과민 한 방법입니다. Zn 측정의 최적화는이 방법을 간단 하 게 적용 하 고 이상적인 분석 조건을 보장 합니다. 여기에서 GF-AAS를 사용 하 여, 우리는 다양 한 세포 주 로부터, 세포 및 핵 분 획에서, 그리고 전체 셀에서 Zn의 농도를 결정 했다. 결과는이 기술이 형광 프로브 및 ICP에 의해 얻어진 것과 비교 하 여 렌더링 한다…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 T.P.에 매사추세츠의과 대학에서 교수진 다양성 학자 상을 지원 했다. N.N.. 는 SEP CONACYT, 보조금 279879에 의해 지원 됩니다. J. g. N은 국립 과학 재단 보조금 DBI 0959476에 의해 지원 됩니다. 저자는 N2A 셀 라인을 제공 하기 위한 닥터 다 릴 a. 보스코와 그녀의 기술 지원에 대 한 다니엘 라 창 Ussu에 감사 드립니다.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma Aldrich | I5879 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1005706 | |
| Anti Brg1-antibody (G7) | Santa Cruz biotechnologies | sc-17796 | |
| Anti b-tubulin-antibody (BT7R) | Thermo Scientific | MA5-16308 | |
| Bradford | Biorad | 5000205 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) | ThermoFischer-Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) | ThermoFischer-Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFischer-Gibco | 14190144 | |
| Epidemal Growth Factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer-Gibco | 16000044 | |
| Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) | ThermoFischer-Gibco | PHG0024 | |
| Horse serum | ThermoFischer-Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Sigma Aldrich | 95321 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-A | ThermoFischer | 51300044 | |
| Nitric Acid (HNO3) | Sigma Aldrich | 438073 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | Thermo Scientific | 85125 | |
| OptiMEM (Reduced Serum Media) | ThermoFischer-Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFischer-Gibco | 15140148 | |
| PureCol (Collagen) | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| Retionic Acid | Sigma Aldrich | PHR1187 | |
| Troglitazone | Sigma Aldrich | 648469-M | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFischer-Gibco | 25200056 | |
| Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 | Perkin Elmer | N9300168 | |
| Established Cell Lines | |||
| 3T3-L1 | American Type Culture Collection | CL-173 | |
| MCDK | American Type Culture Collection | CCL-34 | |
| MCF10A | American Type Culture Collection | CRL-10317 | |
| N2A | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
| Equipment | |||
| Atomic Absortion spectrophotometer | PerkinElmer | Aanalyst 800 | |
| Bioruptor | Diagnode | UCD-200 |
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