Inducir la Periodontitis Apical en Ratones
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para inducir localmente la periodontitis apical en ratones. Mostramos cómo perforar un agujero en el diente del ratón y exponer su pulpa, con el fin de causar inflamación local. También se demuestran métodos de análisis para investigar la naturaleza de esta inflamación, como la microtomografía y la histología.
Abstract
Los mecanismos involucrados en la inflamación inducida local se pueden estudiar utilizando varios modelos animales disponibles. Una de ellas es la inducción de la periodontitis apical (AP). La periodontitis apical es una patología común de naturaleza inflamatoria en los tejidos periodontales que rodean la raíz dental. Para entender mejor la naturaleza y el mecanismo de esta patología es ventajoso realizar el procedimiento en ratones. La inducción de esta inflamación odontogénica se logra perforando en el diente del ratón hasta que la pulpa dental esté expuesta. A continuación, la pulpa dental permanece expuesta a ser contaminada por la flora oral natural con el tiempo, causando periodontitis apical. Después de este período de tiempo, el animal es sacrificado, y el diente y el hueso de la mandíbula se pueden analizar de varias maneras. Los análisis típicos incluyen imágenes de micro-CT (para evaluar la resorción ósea), tinción histológica, inmunohistoquímica y expresión de ARN. Este protocolo es útil para la investigación en el campo de la biología oral para entender mejor este proceso inflamatorio en un entorno experimental in vivo con condiciones uniformes. El procedimiento requiere un manejo cuidadoso de los ratones y la mandíbula aislada, y una demostración visual de la técnica es útil. Se demuestran todos los aspectos técnicos de los procedimientos que conducen a la periodontitis apical inducida y su caracterización en un modelo de ratón.
Introduction
El objetivo de este método es inducir la periodontitis apical en un ratón contaminando el ápice con la microflora natural, y luego estudiar varias características de este proceso patológico.
La periodontitis apical (AP) es una patología común de naturaleza inflamatoria en los tejidos periodontales que rodean la raíz dental. Esta enfermedad dental puede causar dolor intenso y debe ser tratada por un dentista. Las opciones de tratamiento incluyen tratamiento de conducto radicular (primario o secundario), cirugía de endodoncia, extracción dental o seguimiento dependiendo de los hallazgos clínicos y radiográficos, y la opinión del médico. El mecanismo de este proceso inflamatorio, aunque estudiado durante varias décadas1,2,3, todavía no se entiende exhaustivamente. Teniendo en cuenta la gravedad de esta patología, existe, por tanto, una clara necesidad de investigación que aborde su naturaleza fundamental. Por lo tanto, los sistemas donde el estudio de AP es posible son de gran interés científico.
Puesto que la AP es un proceso patológico complejo que involucra los tejidos locales y el sistema inmunológico, los estudios in vitro son insuficientes para una comprensión completa de los procesos. El estudio de muestras clínicas de esta enfermedad también son problemáticos debidoa limitaciones éticas y variabilidad significativa entre diferentes personas y diferentes etapas clínicas 4,5, y por lo tanto la necesidad de modelos in vivo. Estos modelos se basan en el concepto de exponer la pulpa dental a la contaminación y observar la reacción inflamatoria del cuerpo a este estímulo en los tejidos periapicales6,7. Los modelos in vivo comunes incluyen roedores o animales más grandes como perros. A pesar del desafío clínico en el tratamiento de ratones, que son animales muy pequeños con dientes en miniatura, las ventajas del modelo de ratón son significativas: prácticamente, trabajar con ratones es técnicamente simple en términos de instalaciones y es más rentable, y científicamente, el ratón es un modelo animal bien estudiado con herramientas genéticas y moleculares fácilmente disponibles y un genoma bien estudiado. De hecho, estudios previos utilizaron un modelo de ratón para estudiar señales de resorción inflamatorias y óseas y células implicadas en la periodontitis apical8,9,10,11. Por lo tanto, se necesita un protocolo claro sobre cómo utilizar un modelo de ratón para el estudio del AP. Aquí, describimos tal protocolo.
El protocolo descrito aquí tiene la gran ventaja de ser apropiado para estudiar ratones knock-out (KO) y aprender cómo la falta de un gen específico afecta la inflamación dental7,12. Otras aplicaciones útiles de este protocolo incluyen el estudio de los efectos de los medicamentos y las condiciones sistémicas en el desarrollo de la periodontitis apical13,el efecto de la periodontitis apical en el desarrollo de osteonecrosis de las mandíbulas14 , 15 y terapia con células madre para la regeneración ósea16.
Este protocolo también se puede generalizar como un modelo para estudiar la inflamación local. Para estudiar el proceso inflamatorio, se han desarrollado varios modelos de ratón, que incluyen por ejemplo colitis inducida o artritis17,18. Estos modelos tienen efectos sistémicos y no tienen control incorporado en el mismo animal. Los modelos de periodontitis apical inducida, que incluyen un control contralateral sin inflamación, tienen la ventaja de superar estas limitaciones14,19.
El protocolo descrito a continuación es por lo tanto útil para los investigadores que están interesados en los procesos inflamatorios locales. La naturaleza controlada de esta inflamación, su confinamiento a un lugar específico, y el diente de control contralateral, hacen que este protocolo sea valioso para el estudio de los mecanismos involucrados en este proceso. Además, el protocolo es útil para los investigadores interesados en los aspectos clínicos de la inflamación periapical. El modelo de ratón es ideal para estudiar diferentes variables de la enfermedad, además de la ventaja de poder realizar fácilmente manipulaciones genéticas en el modelo de ratón, para investigar la actividad de genes específicos en la inflamación periapical.
Técnicamente, el procedimiento clínico es difícil de llevar a cabo debido a las pequeñas dimensiones de los dientes de los ratones. Será beneficioso visualizar este procedimiento con el fin de aprender sobre el posicionamiento, el equipo necesario y el rendimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se introduce un método para la inducción de la periodontitis apical en ratones. El objetivo del método es explotar la condición de periodontitis apical para el estudio de los mecanismos y consecuencias de este proceso inflamatorio. La periodontitis apical fue inducida en ratones de 6-8 semanas de edad, una edad en la que las raíces están completamente desarrolladas24. Con el fin de causar periodontitis apical en este modelo, la pulpa dental de los molares mandibulares del …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer al Dr. Oded Heyman por su ayuda con el posicionamiento animal, A Rafael Lieber por su ayuda con el análisis de micro-CT, y la Prof. Andiara De Rossi Daldegan por su consejo sobre la preformación del experimento. También nos gustaría reconocer al Dr. Sidney Cohen por su lectura y edición críticas.
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Dr. Izador I. Cabakoff Research Endowment Fund a MK e IA, y una beca Yitzhak Navon del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel a EG.
Materials
| Atipamezole hydrochloride | Eurovet Animal Health | CAS 104075-48-1 | |
| ATR | dentsply | tecnika | |
| blocking machine | Leica | EG1150H | |
| buprenorphine | vetmarket | 163451 | |
| clinical microscope/binocular | Olympus | Sz61 | |
| dental bur | Komet dental | ZR8801L 315 008 | |
| dental spatula | Premier | 1003737 | |
| EDTA | J.T Baker | 8993 | |
| entelan | mercury | 1.07961 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | SIGMA | HT110116 | |
| hematoxylin solution, Mayer's | SIGMA | MHS 16 | |
| Ketamine hydrochloride | Vetoquinol | CAS 1867-669 | |
| Medetomidine hydrochloride (cepetor) | CP-pharma GmbH | CAS 86347-15-1 | |
| Mepivacaine HCl 3% | Teva | CAS 96-88-8 | |
| microbrushes- adjustable precision applicators | PARKELL | S379 | |
| micro-ct scanner | scanco | uCT 40 | |
| parafin | Leica | 39602004 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| PFA | EMS | 15710 | |
| Chloramphenicol eye ointment (5%) | Rekah pharmaceutical | CAS 56-75-7 | |
| tweezers | WAM | Ref-CT | |
| xylazine | Eurovet Animal Health | CAS 7361-61-7 | |
| xylene | Gadot | CAS 1330-20-7 |
Referenzen
- Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
- Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
- Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
- Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
- Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
- Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
- Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
- Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
- Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
- Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
- De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
- Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
- Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
- Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
- Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
- Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
- Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
- Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
- Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
- Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
- Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
- Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
- Metzger, Z. Macrophages in periapical lesions. Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).
- Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
- Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
- Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
- Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
- Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
- AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).
