Visualisation de la protéine Kinase Une activité chez des souris à behaving à l'aide de la microscopie d'imagerie à deux photons in vivo fluorescence à vie
Summary
Une procédure est présentée pour visualiser les activités de kinase a de protéine dans les souris head-fixed, se comportant. Un journaliste amélioré d’activité de A-kinase, tAKARMD, est exprimé dans les neurones corticaux et rendu accessible pour la formation image par une fenêtre crânienne. La microscopie d’imagerie à vie à deux photons est utilisée pour visualiser les activités de LPJ in vivo pendant la locomotion forcée.
Abstract
La neuromodulation exerce un contrôle puissant sur le fonctionnement du cerveau. La dysfonction des systèmes neuromodulatoires entraîne des troubles neurologiques et psychiatriques. Malgré leur importance, les technologies de suivi des événements neuromodulatoires avec résolution cellulaire commencent à peine à émerger. Les neuromodulateurs, tels que la dopamine, la noradrénaline, l’acétylcholine et la sérotonine, déclenchent des événements de signalisation intracellulaire s’il y a des signaux intracellulaires par l’intermédiaire de leurs récepteurs couplés aux protéines G respectifs afin de moduler l’excitabilité neuronale, les communications synaptiques et d’autres fonctions, régulant ainsi le traitement de l’information dans le réseau neuronal. Les neuromodulateurs mentionnés ci-dessus convergent vers la voie cAMP/protéine kinase A (PKA). Par conséquent, la formation image in vivo de PKA avec la résolution unicellulaire a été développée comme readout pour des événements neuromodulatoires d’une manière analogue à l’imagerie de calcium pour des activités électriques neuronales. Ici, une méthode est présentée pour visualiser l’activité de PKA au niveau des neurones individuels dans le cortex des souris se comportant head-fixed. Pour ce faire, un journaliste d’activité A-kinase amélioré (AKAR), appelé tAKARMD, est utilisé, qui est basé sur le transfert d’énergie de résonance de Fârster (FRET). Ce capteur PKA génétiquement codé est introduit dans le cortex moteur par électroporation in utero (IUE) des plasmides d’ADN, ou injection stéréotaxique du virus adéno-associé (AAV). Les changements de FRET sont représentés à l’aide de la microscopie d’imagerie à vie à deux photons (2pFLIM), qui offre des avantages par rapport aux mesures fret ratiométriques pour quantifier le signal FRET dans le tissu cérébral qui disperse la lumière. Pour étudier les activités de La PKA pendant la locomotion forcée, tAKAREstEst est représenté à travers une fenêtre crânienne chronique au-dessus du cortex des souris éveillées, fixées à la tête, qui courent ou se reposent sur un tapis roulant motorisé à commande de vitesse. Cette approche d’imagerie s’appliquera à de nombreuses autres régions du cerveau pour étudier les activités Correspondantes de LTP induites par le comportement et à d’autres capteurs FLIM pour l’imagerie in vivo.
Introduction
La neuromodulation, également connue sous le nom de transmission synaptique lente, impose un contrôle fort sur la fonction cérébrale pendant différents états comportementaux, tels que le stress, l’excitation, l’attention, et la locomotion1,2,3, 4. Malgré son importance, l’étude du moment et de l’endroit où se déroulent les événements neuromodulatoires en est encore à ses balbutiements. Les neuromodulateurs, y compris l’acétylcholine, la dopamine, la noradrénaline, la sérotonine et de nombreux neuropeptides, activent les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), qui déclenchent à leur tour des voies intracellulaires de deuxième messager avec une large fenêtre d’échelles de temps allant de secondes à quelques heures. Tandis que chaque neuromodulateur déclenche un ensemble distinct d’événements de signalisation, la voie de kinase A de cAMP/protéine est une voie en aval commune pour beaucoup de neuromodulators1,5. La voie cAMP/PKA régule l’excitabilité neuronale, la transmission synaptique et la plasticité6,7,8,9, et donc, accorde la dynamique neuronale du réseau. Étant donné que différents neurones ou types neuronaux expriment différents types ou niveaux de récepteurs neuromodulateurs10, les effets intracellulaires du même neuromodulateur extracellulaire peuvent être hétérogènes à travers différents neurones, et doivent donc être avec résolution cellulaire. À ce jour, il reste difficile de surveiller les événements neuromodulatoires dans les neurones individuels in vivo pendant le comportement.
Pour étudier la dynamique spatiotemporale de la neuromodulation, une modalité appropriée d’enregistrement est exigée. La microdialyse et la voltamétrie cyclique à balayage rapide sont fréquemment utilisées pour étudier la libération des neuromodulateurs, mais ils n’ont pas la résolution spatiale pour surveiller les événements cellulaires11,12. Analogue à la dynamique du calcium utilisé comme un proxy pour l’activité électrique neuronale dans l’imagerie de la population13, pDJ peut être utilisé pour lire les événements neuromodulatoires à travers une population neuronale à la résolution cellulaire. Le protocole actuel décrit l’utilisation d’un journaliste d’activité A-kinase amélioré (AKAR) pour surveiller les activités De PKA in vivo pendant le comportement animal. La méthode décrite ici permet l’imagerie simultanée des populations neuronales à la résolution subcellulaire avec une résolution temporelle qui suit les événements neuromodulatoires physiologiques.
Les AKAR sont composés d’un donneur et d’un accepteur de protéines fluorescentes reliées par un peptide de substrat de phosphorylation PKA et d’un domaine associé à la tête de fourchette (FHA) qui se lie à la sérine phosphorylée ou à la thréonine du substrat14,15. Lors de l’activation de la voie PKA, le peptide de substrat d’AKAR est phosphorylé. En conséquence, le domaine FHA se lie au peptide phosphorylé de substrat, amenant de ce fait les deux fluorophores à proximité, dénommé l’état fermé d’AKAR. L’état fermé d’un AKAR phosphorylé entraîne une augmentation du transfert d’énergie par résonance (FRET) entre le donneur et les fluorophores accepteurs. Étant donné que la proportion d’AKAR phosphorylés est liée au niveau d’activité PKA16, la quantité de FRET dans un échantillon biologique peut être utilisée pour quantifier le niveau d’activité PKA16,17,18, 19,20.
Les premières versions des RLA ont été principalement conçues pour l’imagerie ratiométrique à deux couleurs14. Lors de l’imagerie plus profondément dans le tissu cérébral, la méthode ratiométrique souffre de distorsion du signal due à la diffusion de la lumière dépendante de la longueur d’onde17,18,21. Comme nous l’avons vu ci-dessous, la microscopie d’imagerie à vie par fluorescence (FLIM) élimine ce problème parce que la FLIM ne mesure que les photons émis par le fluorophore du donneur18,21. En conséquence, la quantification FLIM de FRET n’est pas affectée par la profondeur tissulaire17. En outre, une variante « foncée » (c.-à-d. faible rendement quantique [QY]) du fluorophore accepteur peut être utilisée. Cela libère un canal de couleur pour faciliter la mesure multiplexée des propriétés neuronales orthogonales par l’imagerie simultanée d’un deuxième capteur ou d’un marqueur morphologique17,19,20.
L’imagerie FLIM quantifie le temps qu’un fluorophore passe dans l’état excité, c’est-à-dire la durée de vie de la fluorescence18. Le retour d’un fluorophore à l’état de sol, donc la fin de l’état excité, se concomite souvent avec l’émission d’un photon. Bien que l’émission d’un photon pour une molécule excitée individuelle soit stochastique, dans une population la durée de vie moyenne de fluorescence est une caractéristique de ce fluorophore particulier. Quand une population pure de fluorophores sont excitées simultanément, la fluorescence résultante suivra une seule décomposition exponentielle. La constante temporelle de cette carie exponentielle correspond à la durée de vie moyenne de la fluorescence, qui varie généralement de une à quatre nanosecondes pour les protéines fluorescentes. Le retour d’un fluorophore donneur excité à l’état du sol peut également se produire par FRET. En présence de FRET, la durée de vie de fluorescence du fluorophore donneur est réduite. Les AKAR non phosphorylés présentent une durée de vie relativement plus longue de fluorescence des donneurs. Lors de la phosphorylation par PKA, le capteur montre une durée de vie plus courte parce que le donneur et les fluorophores accepteurs sont amenés près de l’autre et FRET est augmenté. La quantification de la durée de vie de la fluorescence dans une population d’AKAR représente donc le niveau d’activité de la PKA.
Les premières versions des RCR n’ont pas été utilisées avec succès pour l’imagerie in vivo à résolution monocellulaire. Cela est principalement dû à l’amplitude du signal faible des capteurs AKAR aux activations physiologiques17. Récemment, en comparant systématiquement les capteurs AKAR disponibles pour la microscopie d’imagerie à vie à deux photons (2pFLIM), un capteur appelé FLIM-AKAR a été trouvé pour surpasser les capteurs alternatifs. En outre, une série de variantes FLIM-AKAR appelées AKAR ciblées (tAKARs) ont été développées pour visualiser l’activité de La PKA à des endroits sous-cellulaires spécifiques : microtubules (tAKARMD), cytosol (tAKARMD), actine (tAKARMD), actine filamentuse (tAKARMD), membrane (tAKARMD), et la densité postsynaptique (tAKAR- ). Parmi les tAKAR, le tAKARMD a multiplié par 2,7 l’amplitude du signal obtenue par la noradrénaline. Ceci est compatible avec la connaissance que la majorité de PKA dans les neurones sont ancrés aux microtubules à l’état de repos22,23. tAKAR a été le meilleur performer parmi les AKAR existants pour 2pFLIM. En outre, tAKARMD a détecté l’activité physiologiquement pertinente de PKA obtenue par les neuromodulators multiples, et l’expression de tAKAR mD n’a pas modifié des fonctions neuronales17.
Récemment, tAKAR a été utilisé avec succès pour visualiser les activités PKA chez les souris de comportement fixes à la tête17. Il a été démontré que la locomotion forcée déclenchait l’activité de la PKA dans le soma des neurones de couche superficielle (couche 1 à 3, jusqu’à une profondeur de 300 m de pia) dans le moteur, le baril et les cortices visuels. L’activité de PKA locomotion-déclenchée a été en partie dépendante de la signalisation par l’intermédiaire des récepteurs adrénergiques et des récepteurs de dopamine d’A1, mais n’a pas été affectée par un antagoniste de récepteur de dopamine de D2. Ce travail illustre la capacité des tAKARs à suivre les événements de neuromodulation in vivo à l’aide de 2pFLIM.
Dans le protocole actuel, la méthode entière pour l’imagerie d’activité de PKA dans les souris éveillées tête-fixes pendant un paradigme forcé de locomotion est décrite en six étapes. Tout d’abord, l’ajout de capacités 2pFLIM à un microscope conventionnel à deux photons (figure 1). Deuxièmement, la construction d’un tapis roulant motorisé (figure 2). Troisièmement, l’expression du capteur tAKARMD dans le cortex de la souris par électroporation in utero (IUE) des plasmides d’ADN, ou injection stéréotaxique du virus adéno-associé (AAV). D’excellents protocoles pour les chirurgies pour IUE24,25 et l’injection stéréotaxique de particules virales26 ont été précédemment publiés. Les paramètres clés que nous avons utilisés sont décrits ci-dessous. Forth, l’installation d’une fenêtre crânienne. D’excellents protocoles ont déjà été publiés pour la chirurgie de fenêtre crânienne27,28. Plusieurs étapes qui ont été modifiées à partir des protocoles standard sont décrites. Cinquième, effectuer in vivo 2pFLIM. Sixièmement, les analyses des images 2pFLIM (figure3 et figure 4). Cette approche devrait être facilement applicable à beaucoup d’autres paradigmes comportementaux et zones cérébrales fixés à la tête.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole démontre l’utilisation du capteur FRET-FLIM tAKARMD pour visualiser l’activité PKA déclenchée par la neuromodulation chez les souris ayant un comportement fixe à la tête. Cette application est basée sur des tests approfondis et des caractérisations de tAKARMD in vitro et in vivo pour démontrer que le signal FLIM obtenu est pertinent pour les événements neuromodulatoires physiologiques17. Ici, une application in vivo, l’activité PKA induite par la locomotion dans le cortex …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mme Tess J. Lameyer, Mme Ruth Frank et le Dr Michael A. Muniak pour les modifications et les commentaires, et le Dr Ryohei Yasuda de Max Planck Florida pour le logiciel d’acquisition 2pFLIM. Ce travail a été soutenu par deux prix BRAIN Initiative U01NS94247 (H.Z. et T.M.) et R01NS104944 (H.Z. et T.M.), une subvention R01RS081071 (T.M.), et une subvention R21NS097856 (H.Z.). Tous les prix proviennent du National Institute of Neurological Disorders and Stroke, États-Unis.
Materials
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
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