Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy
Summary
Ein Verfahren wird vorgestellt, um Proteinkinase-A-Aktivitäten in kopffesten, sich verhaltenden Mäusen zu visualisieren. Ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter, tAKAR, wird in kortikalen Neuronen ausgedrückt und für die Bildgebung durch ein Schädelfenster zugänglich gemacht. Die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Bildmikroskopie wird verwendet, um PKA-Aktivitäten in vivo während der erzwungenen Fortbewegung zu visualisieren.
Abstract
Neuromodulation übt starke Kontrolle über die Gehirnfunktion aus. Dysfunktion der neuromodulatorischen Systeme führt zu neurologischen und psychiatrischen Störungen. Trotz ihrer Bedeutung, Technologien für die Verfolgung neuromodulatorischen Ereignisse mit zellulärer Auflösung sind gerade erst beginnen zu entstehen. Neuromodulatoren, wie Dopamin, Noradrenalin, Acetylcholin und Serotonin, lösen intrazelluläre Signalereignisse über ihre jeweiligen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren aus, um neuronale Erregbarkeit, synaptische Kommunikation und andere neuronale Funktionen, wodurch die Informationsverarbeitung im neuronalen Netzwerk reguliert wird. Die oben genannten Neuromodulatoren konvergieren auf den cAMP/Proteinkinase A (PKA) Weg. Daher wurde die in vivo PKA-Bildgebung mit einzelzelliger Auflösung als Auslese für neuromodulatorische Ereignisse in einer Art und Weise entwickelt, die der Kalzium-Bildgebung für neuronale elektrische Aktivitäten entspricht. Hierbei wird eine Methode zur Visualisierung der PKA-Aktivität auf der Ebene einzelner Neuronen im Kortex von kopffixierten Benehmen von Mäusen vorgestellt. Dazu kommt ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter (AKAR), genannt tAKAR, zum Einsatz, der auf der Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET) basiert. Dieser genetisch kodierte PKA-Sensor wird über die Utero-Elektroporation (IUE) von DNA-Plasmiden oder die stereotaxic-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) in den motorischen Kortex eingeführt. FRET-Änderungen werden mit der zweiphotonenfluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (2pFLIM) dargestellt, die Vorteile gegenüber ratiometrischen FRET-Messungen zur Quantifizierung des FRET-Signals im lichtstreuenden Hirngewebe bietet. Um PKA-Aktivitäten während der erzwungenen Fortbewegung zu untersuchen, wird tAKAR durch ein chronisches Schädelfenster über dem Kortex von wachen, kopffixierten Mäusen abgebildet, die auf einem geschwindigkeitsgesteuerten motorisierten Laufband laufen oder ruhen. Dieser bildgebende Ansatz wird auf viele andere Hirnregionen anwendbar sein, um entsprechende verhaltensinduzierte PKA-Aktivitäten zu untersuchen, und auf andere FLIM-basierte Sensoren für die In-vivo-Bildgebung.
Introduction
Neuromodulation, auch bekannt als langsame synaptische Übertragung, erzwingt eine starke Kontrolle über die Gehirnfunktion während verschiedener Verhaltenszustände, wie Stress, Erregung, Aufmerksamkeit, und Fortbewegung1,2,3, 4. Trotz seiner Bedeutung steckt die Untersuchung, wann und wo neuromodulatorische Ereignisse stattfinden, noch in den Kinderschuhen. Neuromodulatoren, einschließlich Acetylcholin, Dopamin, Noradrenalin, Serotonin und viele Neuropeptide, aktivieren G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die wiederum intrazelluläre zweite Botenwege mit einem breiten Zeitskala-Spektrum auslösen von Sekunden bis Stunden. Während jeder Neuromodulator eine reihe von Signalereignissen auslöst, ist der cAMP/Proteinkinase A (PKA) Signalweg ein gemeinsamer downstreamer Weg für viele Neuromodulatoren1,5. Der cAMP/PKA-Signalweg reguliert die neuronale Erregbarkeit, synaptische Übertragung und Plastizität6,7,8,9, und stimmt daher die neuronale Netzwerkdynamik an. Da verschiedene Neuronen oder neuronale Typen unterschiedliche Typen oder Ebenen von Neuromodulatorrezeptorrezeptoren10ausdrücken, können die intrazellulären Wirkungen desselben extrazellulären Neuromodulators über verschiedene Neuronen hinweg heterogen sein und müssen daher mit zellulärer Auflösung untersucht. Bis heute, Es bleibt schwierig, neuromodulatorische Ereignisse in einzelnen Neuronen in vivo während des Verhaltens zu überwachen.
Um die raumzeitliche Dynamik der Neuromodulation zu untersuchen, ist eine geeignete Aufzeichnungsmodalität erforderlich. Mikrodialyse und schnell-scanzyklische Voltammetrie werden häufig verwendet, um die Freisetzung von Neuromodulatoren zu untersuchen, aber sie haben keine räumliche Auflösung, um zelluläre Ereignisse zu überwachen11,12. Analog zu Kalzium-Dynamik als Proxy für neuronale elektrische Aktivität in der Population Bildgebung verwendet werden13,PKA-Bildgebung kann verwendet werden, um neuromodulatorische Ereignisse über eine neuronale Bevölkerung bei zellulärer Auflösung auszulesen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung eines verbesserten A-Kinase-Aktivitätsreporters (AKAR), um PKA-Aktivitäten in vivo während des Verhaltens von Tieren zu überwachen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung neuronaler Populationen mit subzellulärer Auflösung mit einer zeitlichen Auflösung, die physiologische neuromodulatorische Ereignisse nachverfolgt.
AKARs bestehen aus einem Spender und einem Akzeptor fluoreszierenden Proteinen, die durch ein PKA-Phosphorylierungssubstratpeptid und eine Gabelkopf-assoziierte Domäne (FHA) miteinander verbunden sind, die an das phosphorylierte Serin oder Threonin des Substrats14,15bindet. Bei Aktivierung des PKA-Signalwegs wird das Substratpeptid von AKAR phosphoryliert. Dadurch bindet die FHA-Domäne an das phosphorylierte Substratpeptid und bringt so die beiden Fluorophore in die Nähe, die als geschlossener Zustand von AKAR bezeichnet werden. Der geschlossene Zustand eines phosphorylierten AKAR führt zu einer erhöhten Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET) zwischen Spender und Akzeptorfluorophoren. Da der Anteil der phosphorylierten AKARs mit dem Niveau der PKA-Aktivität16zusammenhängt, kann die Menge an FRET in einer biologischen Probe verwendet werden, um das Niveau der PKA-Aktivität16,17,18, 19,20.
Frühe Versionen von AKARs wurden in erster Linie für zweifarbige ratiometrische Bildgebung14entwickelt. Bei der Tieferung der Bildgebung in das Hirngewebe leidet die ratiometrische Methode unter Signalverzerrungen durch wellenlängenabhängige Lichtstreuung17,18,21. Wie unten erläutert, beseitigt die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) dieses Problem, da FLIM nur Photonen misst, die vom Spenderfluorophor18,21emittiert werden. Daher ist die FLIM-Quantifizierung von FRET nicht von der Gewebetiefe17betroffen. Darüber hinaus kann eine “dunkle” (d.h. niedrige Quantenausbeute [QY]) Variante des Akzeptorfluorophors verwendet werden. Dies befreit einen Farbkanal, um die Multiplexmessung orthogonaler neuronaler Eigenschaften durch gleichzeitige Abbildung eines zweiten Sensors oder eines morphologischen Markers17,19,20zu erleichtern.
FLIM Imaging quantifiziert die Zeit, die ein Fluorophor im angeregten Zustand verbringt, d.h. die Fluoreszenzlebensdauer18. Die Rückkehr eines Fluorophors in den Bodenzustand, also das Ende des aufgeregten Zustandes, koncomitiert oft mit der Emission eines Photons. Obwohl die Emission eines Photons für ein einzelnes angeregtes Molekül stochastisch ist, ist in einer Population die mittlere Fluoreszenzlebensdauer ein Merkmal dieses bestimmten Fluorophors. Wenn eine reine Population von Fluorophoren gleichzeitig angeregt wird, folgt die resultierende Fluoreszenz einem einzigen exponentiellen Zerfall. Die Zeitkonstante dieses exponentiellen Zerfalls entspricht der mittleren Fluoreszenzlebensdauer, die bei fluoreszierenden Proteinen in der Regel zwischen einer und vier Nanosekunden liegt. Die Rückkehr eines angeregten Spenderfluorophors in den Bodenzustand kann auch durch FRET erfolgen. In Gegenwart von FRET wird die Fluoreszenzlebensdauer des Spenderfluorophors reduziert. Die nichtphosphorylierten AKARs weisen eine relativ längere Spenderfluoreszenzlebensdauer auf. Nach der Phosphorylierung durch PKA weist der Sensor eine kürzere Lebensdauer auf, da Spender- und Akzeptorfluorophore nahe beieinander gebracht werden und FRET erhöht wird. Die Quantifizierung der Fluoreszenzlebensdauer in einer Population von AKARs stellt daher das Niveau der PKA-Aktivität dar.
Frühe Versionen von AKARs wurden nicht erfolgreich für die In-vivo-Bildgebung bei einzelliger Auflösung eingesetzt. Dies ist vor allem auf die geringe Signalamplitude der AKAR-Sensoren zu physiologischen Aktivierungen17zurückzuführen. Kürzlich wurde durch den systematischen Vergleich verfügbarer AKAR-Sensoren für die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Mikroskopie (2pFLIM) ein Sensor namens FLIM-AKAR gefunden, der alternative Sensoren übertrifft. Darüber hinaus wurde eine Reihe von FLIM-AKAR-Varianten, die als gezielte AKARs (tAKARs) bezeichnet werden, entwickelt, um die PKA-Aktivität an bestimmten subzellulären Standorten zu visualisieren: Mikrotubuli (tAKAR), Cytosol (tAKAR), Actin (tAKAR), fadenförmiges Actin (tAKAR), Membran (tAKAR), postsynaptische Dichte (tAKAR). Bei den tAKARs erhöhte tAKAR die Signalamplitude, die durch Noradrenalin ausgelöst wurde, um das 2,7-fache. Dies steht im Einklang mit dem Wissen, dass die Mehrheit der PKA in Neuronen in Mikrotubuli im Ruhezustand verankert sind22,23. tAKAR war der beste Performer unter den bestehenden AKARs für 2pFLIM. Darüber hinaus erkannte tAKAR-Funktion physiologisch relevante PKA-Aktivität, die von mehreren Neuromodulatoren ausgelöst wurde, und die Expression von tAKAR-Funktion verändert enden keine neuronalen Funktionen17.
Kürzlich wurde tAKAR- erfolgreich eingesetzt, um PKA-Aktivitäten bei kopffixierten Benahmemäusen17zu visualisieren. Es wurde gezeigt, dass erzwungene Fortbewegung DIE PKA-Aktivität im Soma der oberflächlichen Schichtneuronen (Schicht 1 bis 3, bis zu einer Tiefe von 300 m von Pia) im Motor, Fass und visuellen Kortiken auslöste. Die durch Fortbewegung ausgelöste PKA-Aktivität war zum Teil von der Signalisierung über adrenerge Rezeptoren und D1-Dopamin-Rezeptoren abhängig, wurde aber nicht von einem D2-Dopamin-Rezeptor-Antagonisten beeinflusst. Diese Arbeit veranschaulicht die Fähigkeit von tAKARs, Neuromodulationsereignisse in vivo mit 2pFLIM zu verfolgen.
Im aktuellen Protokoll wird die gesamte Methode zur PKA-Aktivitätsbildgebung bei kopffesten Wachmäusen während eines erzwungenen Fortbewegungsparadigmas in sechs Schritten beschrieben. Erstens, die Hinzufügung von 2pFLIM-Fähigkeiten zu einem herkömmlichen Zwei-Photon-Mikroskop (Abbildung 1). Zweitens der Bau eines motorisierten Laufbandes (Abbildung 2). Drittens, die Expression des tAKAR-Sensors im Mauskortex durch Utero-Elektroporation (IUE) von DNA-Plasmiden oder stereotaxic-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV). Ausgezeichnete Protokolle für Operationen für IUE24,25 und stereotaxic Injektion von Viruspartikeln26 wurden bereits veröffentlicht. Die wichtigsten Parameter, die wir verwendet haben, werden unten beschrieben. Forth, die Installation eines Schädelfensters. Ausgezeichnete Protokolle wurden bereits für die Schädelfensterchirurgie veröffentlicht27,28. Es werden mehrere Schritte beschrieben, die aus den Standardprotokollen geändert wurden. Fünftens, Durchführung in vivo 2pFLIM. Sechstens, die Analysen von 2pFLIM-Bildern (Abbildung 3 und Abbildung 4). Dieser Ansatz sollte leicht auf viele andere kopffixierte Verhaltensparadigmen und Gehirnbereiche anwendbar sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des FRET-FLIM-Sensors tAKAR, um neuromodulationsgesteuerte PKA-Aktivität bei kopffixierten Verhaltensmäusen zu visualisieren. Diese Anwendung basiert auf umfangreichen Tests und Charakterisierungen von tAKAR in vitro und in vivo, um zu zeigen, dass das erhaltene FLIM-Signal für physiologische neuromodulatorische Ereignisse relevant ist17. Hier wird eine In-vivo-Anwendung, die bewegungsinduzierte PKA-Aktivität im motorischen Kortex, verwendet, um die…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Frau Tess J. Lameyer, Frau Ruth Frank und Dr. Michael A. Muniak für die Bearbeitungen und Kommentare und Dr. Ryohei Yasuda von Max Planck Florida für 2pFLIM Akquisitionssoftware. Diese Arbeit wurde unterstützt durch zwei BRAIN Initiative Auszeichnungen U01NS094247 (H.Z. und T.M.) und R01NS104944 (H.Z. und T.M.), ein R01 Stipendium R01NS081071 (T.M.) und ein R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alle Auszeichnungen stammen vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, USA.
Materials
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
Referenzen
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