Implementación de un microscopio no lineal basado en la dispersión estimulada de Raman
Summary
En este manuscrito, se describe la implementación de un microscopio de dispersión Raman (SRS) estimulado, obtenido mediante la integración de una configuración experimental SRS con un microscopio de escaneo láser. El microscopio SRS se basa en dos fuentes láser de femtosegundo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) y un oscilador paramétrico óptico sincronizado (OPO).
Abstract
La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) utiliza luz de excitación infrarroja cercana; por lo tanto, comparte muchas propiedades de imágenes microscópicas multifono. La modalidad de imagen SRS se puede obtener utilizando microscopios comerciales de exploración láser equipando con un detector de avance no desescaneado con filtros de paso de banda adecuados y un esquema de detección de amplificador de bloqueo (LIA). Un diseño esquemático de un microscopio SRS típico incluye lo siguiente: dos rayos láser pulsados, (es decir, la bomba y la sonda dirigidas en un microscopio de escaneo), que deben superponerse tanto en el espacio como en el tiempo en el plano de la imagen, y luego enfocarse mediante un objetivo de microscopio la muestra a través de dos espejos de exploración (SM), que rasterizan el punto focal a través de un plano x-y. Después de la interacción con la muestra, los pulsos de salida transmitidos son recogidos por un objetivo superior y medidos por un sistema de detección hacia adelante insertado en un microscopio invertido. Los pulsos de la bomba se eliminan mediante una pila de filtros ópticos, mientras que los pulsos de la sonda que son el resultado del proceso SRS que se produce en el volumen focal de la muestra se miden mediante un fotodiodo (PD). La lectura de los datos sobre el rendimiento es demodulada por la LIA para extraer la profundidad de modulación. Se obtiene una imagen bidimensional (2D) sincronizando la unidad de detección directa con la unidad de escaneo del microscopio. En este artículo, se describe y demuestra con éxito la implementación de un microscopio SRS, así como la notificación de imágenes sin etiquetas de perlas de poliestireno con diámetros de 3 m. Vale la pena señalar que los microscopios SRS no están disponibles comercialmente, por lo que para aprovechar estas características, la construcción casera es la única opción. Dado que la microscopía SRS se está volviendo popular en muchos campos, se cree que esta descripción cuidadosa de la implementación del microscopio SRS puede ser muy útil para la comunidad científica.
Introduction
En aplicaciones de ciencias de la vida, la microscopía SRS ha surgido como una poderosa herramienta para la creación de imágenes sin etiquetas. La idea básica de la microscopía SRS es combinar la fuerza del contraste vibratorio y su capacidad para adquirir imágenes en pocos segundos.
SRS es un proceso en el que la diferencia de frecuencia entre dos frecuencias de rayos láser (señal de bomba y señal de estoculas a diferentes frecuencias) coincide con la vibración molecular de una muestra investigada, causando dispersión de Raman estimulada y una dispersión significativa de Raman y una dispersión significativa aumento de la señal Stokes. A diferencia de la espectroscopia lineal de Raman, SRS exhibe una dependencia no lineal de los campos de luz entrantes y produce radiación coherente. SRS tiene dos ventajas fundamentales: 1) velocidad, lo que hace que las imágenes sean menos sensibles a los artefactos derivados del movimiento o degradación de la muestra, y 2) una excelente relación señal-ruido (SNR). Además, SRS exhibe un espectro idéntico al Raman espontáneo, y la señal SRS es linealmente proporcional a la concentración del enlace químico excitado1,2,3,4, 5.
En nuestro microscopio, una configuración experimental femtosegundo (fs) SRS se integra con un microscopio óptico invertido equipado con una unidad de escaneo de espejos rápidos (Figura 1)6,7,8. Se utilizan dos fuentes láser pulsadas para implementar este microscopio. El primero es un fs-Ti:Sa con una duración de pulso de aproximadamente 140 fs, tasa de repetición de 80 MHz, y longitudes de onda de emisión en el rango de 680-1080 nm. El segundo, utilizado como haz de sonda y bombeado por Ti:Sa, es un oscilador paramétrico óptico sincronizado femtosegundo (SOPO), con una duración de pulso de aproximadamente 200 fs, tasa de repetición de 80 MHz y longitudes de onda de emisión en el rango de 1000-1600 nm. Cabe señalar que la diferencia mínima de energía fotónica entre el haz Ti:Sa y SOPO es de 2500 cm-1. Por lo tanto, utilizando esta combinación de sistemas láser, sólo la región C-H de alta frecuencia (2800-3200 cm-1) de espectros Raman se puede explorar6,7,8.
Con el fin de crear un microscopio SRS, hay tres cuestiones cruciales a considerar, que se describen en los párrafos sucesivos. El primero es la implementación de un método de transferencia de modulación de alta frecuencia (véase el cuadro 2 y el paso 2.1 del protocolo para una descripción). En una investigación experimental SRS, un parámetro crucial es la sensibilidad del sistema. Una señal SRS se detecta como un pequeño cambio en la intensidad de los haces de excitación; por lo tanto, puede ser corrompido por el ruido de intensidad del láser y el ruido de disparo. Este problema se puede superar integrando este sistema con un método de transferencia de modulación de alta frecuencia (véase el cuadro 2 y el paso 2.1 del protocolo para más detalles). En este método, se utiliza un modulador electroóptico (EOM) para modular la bomba. La modulación transferida al haz de la sonda puede ser detectada por un PD después de bloquear el haz de la bomba con una pila de filtros ópticos [modo de detección de ganancia Raman estimulada (SRG)]. La salida PD está conectada por un filtro de paso bajo a un amplificador de bloqueo (LIA), que demodula la señal medida. Al aumentar la frecuencia de modulación del haz a frecuencias superiores a 1 MHz, se puede obtener el límite intrínseco de los PD.
La segunda cuestión a considerar es la instalación de un soporte mecánico que permite llevar a cabo la detección hacia adelante y al mismo tiempo para preservar la observación del microscopio en el campo brillante. Además, tiene que reducir el ruido debido a la vibración mecánica durante la generación de imágenes y permitir el reposicionamiento preciso del sistema de detección (ver Figura 3 y paso 2.2 del protocolo).
La tercera es la sincronización de la señal adquirida por el esquema de detección sensible a la fase, con el haz colocado en la muestra monitoreado por el cabezal de exploración del microscopio. Para realizar imágenes, los SM requieren tres señales TTL que están disponibles por el controlador del microscopio conectado a la unidad principal de escaneo: reloj de píxeles, sincronización de línea y sincronización de fotogramas. La sincronización se logra mediante el control mediante una tarjeta PCI, las tres señales TTLy la adquisición de una señal de tensión en el canal de salida de LIA 6,7,8. Un software casero ha sido desarrollado y descrito previamente6,7,8, mientras que el hardware del sistema de sincronización se informa en la Figura 4.
Un procedimiento fundamental al llevar a cabo imágenes SRS es la alineación del microscopio. Se realiza en el transcurso de cuatro pasos, que se describen en los párrafos sucesivos. La primera es la superposición espacial de dos haces (véase el paso 3.1 del protocolo). En esta configuración experimental, las dos vigas fueron colinealmente combinadas espacialmente por un espejo dicroico. El paso preliminar es la alineación de OPO y Ti:Sa para que cada uno llegue al microscopio. A continuación, considerando oPO como un haz de referencia y aprovechando un detector sensible a la posición, el Ti:Sa se superpone espacialmente a OPO.
El segundo aspecto crucial es la superposición temporal de dos haces (véase el paso 3.2 del protocolo). Incluso si la bomba y los haces OPO están perfectamente sincronizados9,ya que siguen caminos de haz ligeramente diferentes dentro de la carcasa de OPO, en la salida de OPO tienen un retraso de tiempo de aproximadamente 5 ns y diferencia espacial de 5 cm. Por lo tanto, Ti:Sa y OPO requieren ser re-cronometrados ópticamente para asegurar la superposición temporal en la muestra. Esto se logra típicamente con una línea de retardo óptica finamente ajustable, que en este caso se inserta entre el Ti:Sa y el microscopio (véase la figura 1). Para obtener la superposición temporal de dos vigas, se utilizan dos técnicas. El primero se lleva a cabo utilizando un PD rápido y un osciloscopio, mientras que el segundo se basa en correlaciones auto ópticas y cruzadas. Utilizando la primera técnica, se obtiene una superposición aproximada de dos vigas (incertidumbre de 10 ps), mientras que una superposición temporal precisa de dos vigas se obtiene utilizando un correlator cruzado (resolución de 1 fs).
El tercer aspecto crucial es la alineación de las dos vigas dentro del microscopio (ver paso 3.3 del protocolo). Una observación preliminar de la luz blanca de la muestra permite individuate el campo de visión deseado (FOV). Después, los rayos láser, que entran en el microscopio por un puerto lateral del microscopio, se alinean para alcanzar el PD montado en la parte superior (Figura3). Sin embargo, para una adquisición correcta de la imagen, es necesario establecer una serie de parámetros (por ejemplo, la dimensión de píxel y el tiempo de permanencia del píxel). La frecuencia de muestreo debe respetar la restricción impuesta por el teorema de Nyquist para preservar toda la información de una imagen, mientras que para una correspondencia correcta entre las coordenadas espaciales de píxeles y el valor SRS medido en cada píxel, el tiempo de integración de LIA debe ser igual o comparable al tiempo de permanencia del píxel.
En el paso final de la alineación del microscopio, se llevan a cabo numerosas pruebas para optimizar la alineación espacial y temporal (ver paso 3.4 del protocolo). Se adquieren varias imágenes de transmisión (TI) para Ti:Sa y OPO para optimizar la superposición espacial. En una TI, se utiliza un solo haz, y la intensidad del haz transmitido de la muestra se mide mediante un PD. En el caso de TI realizado por OPO, la señal de salida PD está conectada directamente a la tarjeta PCI, mientras que en el caso de TI realizada por Ti:Sa, la señal de salida PD está conectada a LIA y la salida analógica de LIA está conectada a la tarjeta PCI. Las imágenes de transmisión son muy útiles para optimizar el FOV, la iluminación, la posición focal de los objetivos del microscopio y para comprobar si los dos haces están superpuestos espacialmente6,7,8.
La optimización de la superposición temporal de la bomba y del haz de la sonda se obtiene escaneando la línea de retardo con pasos de 0,001 mm correspondientes a un cambio de tiempo de 3,3 fs y realizando una medición SRS en un único punto de una muestra de perlas de poliestireno de 3 m de diámetro. La amplitud de una señal SRS mide los valores de LIA, en función del retardo de la sonda-bomba, y proporciona un máximo correspondiente a la superposición temporal exacta de los dos haces6,7,8. Antes de concluir, cabe señalar que todos los pasos discutidos son obligatorios para obtener una imagen de alta calidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopía SRS ha llevado la imagen sin etiquetas a nuevas alturas, especialmente en estudios de estructuras biológicas complejas como los lípidos, que son fundamentales para las células y la arquitectura celular. Los lípidos están involucrados en múltiples vías fisiológicas como la producción de membranas biológicas, y sirven como precursores biosintéticos y transductores de señal10. Los lípidos se envasan en orgánulos intracelulares especializados, también llamados gotas de l…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a V. Tufano de IMM CNR por su valiosa asistencia técnica y a Giacomo Cozzi, especialista en productos de Nikon Instruments, por sus útiles debates y soporte continuo. Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Programas Operativos Nacionales Italianos PONa3 00025 (BIOforIU) y por el proyecto de infraestructura de investigación paneuropea Euro-Bioimaging a gran escala.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
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