نموذج الماوس من الاوعيه الدموية غير المتجانسة زرع الطحال لدراسة البيولوجيا خليه الطحال وزرع المناعة
Summary
هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات الجراحية للنموذج الماوس من الاوعيه الدموية غير المتجانسة زرع الطحال ، وهو نموذج صعبه من الناحية الفنية التي يمكن ان تكون بمثابه أداه قويه في دراسة مصير وطول العمر من خلايا الطحال ، أليات الطحال متميزة الخلايا السكانية في تطور المرض ، وزرع المناعة.
Abstract
الطحال هو الجهاز اللمفاوية فريدة من نوعها التي تلعب دورا حاسما في التوازن من الجهاز المناعي والاجهزه التي تكون الدم. المرضي الذين خضعوا لاستئصال الطحال بغض السبب عن الأسباب المسببة هي عرضه لتطوير الساحقة بعد استئصال الطحال العدوى والخبرة زيادة مخاطر التخثر الوريدي العميق والأورام الخبيثة. في الاونه الاخيره ، أشارت الدراسات الوبائية إلى ان استئصال الطحال قد يكون مرتبطا بحدوث امراض القلب والاوعيه الدموية ، مما يوحي بان الوظائف الفسيولوجية لطحال لم يتم الاعتراف بها بعد بشكل كامل. هنا ، ونحن نقدم نموذج الماوس من الاوعيه الدموية غير المتجانسة زرع الطحال ، والتي ليس فقط يمكن استخدامها لدراسة وظيفة والنشاط السلوكي لمجموعات فرعيه الخلايا المناعية الطحال في العمليات البيولوجية المختلفة ، ولكن أيضا يمكن ان تكون أداه قويه لاختبار الإمكانيات العلاجية لزراعه الطحال في بعض الامراض. وتشمل الخطوات الجراحية الرئيسية لهذا النموذج حصاد الطحال المتبرع, أزاله الطحال الأصلي المتلقي, والطحال الترقيع التطعيم. باستخدام سلالات الماوس المنشا (علي سبيل المثال ، الفئران مع CD 45.1/CD 45.2 الخلفيات) ، لاحظنا انه بعد الزرع المتزامن ، هاجرت كل من الخلايا الليمفاوية المستمدة من المانحين والخلية النخاعية من الكسب غير المشروع في وقت لاحق من اليوم السابق للجراحة 1 ، يصاحب ذلك تدفق أنواع متعددة من الخلايا المتلقية ، التالي توليد الوهم فريدة من نوعها. وعلي الرغم من التقنيات الصعبة نسبيا ، يمكن تنفيذ هذا الاجراء مع معدل النجاح > 90 ٪. هذا النموذج يسمح تتبع مصير ، وطول العمر ، ووظيفة من الطحال خلال حاله مستقره وفي وضع المرض بعد زرع الطحال ، التالي تقديم فرصه كبيره لاكتشاف دور متميز للخلايا المناعية المستمدة من الطحال في مختلف العمليات المرض.
Introduction
الطحال هو أكبر جهاز لمفاوي ثانوي في الجسم ، وهو أمر بالغ الاهميه في الجهاز المناعي والاجهزه التي تكون الدم. وتضطلع بمهامها في المقام الأول من قبل اثنين من المقصورات المتميزة شكليا, اللب الأحمر واللب الأبيض1. اللب الأحمر هو العمل ثلاثي الابعاد من الجيوب الوريدية والحبال الطحال التي تتكون من ألياف شبكي ، خلايا شبكي ، والضامة المرتبطة بها. هذا الهيكل الفريد يسمح للب الأحمر بالعمل كفلتر دم فعال يزيل المواد الاجنبيه والكريات الحمر القديمة أو التالفة. ويشمل اللب الأبيض بصيلات, منطقه هامشيه, والبيريارتيريولار اللمفاوية (الزملاء) وهو موقع مهم لمحاصره مستضد ومعالجه, اللمفاوية الموجه, التحول, انتشار, ونضوج2. ومع ذلك, وقد اعتبر الطحال عاده كجهاز استغناء عن لان الاجهزه اللمفاوية الأخرى, مثل الغدد الليمفاوية, يمكن أيضا تنفيذ بعض وظائفها وفقدان الطحال لا يؤدي عاده إلى الموت. ولذلك تم اجراء استئصال الطحال علي نطاق واسع كطريقه علاجيه للمرضي الذين يعانون من إصابات الطحال أو امراض الدم الحميدة3. ومع ذلك ، يواجه المرضي الذين يعانون من استئصال الطحال عددا من المضاعفات علي المدى الطويل. التهابات البكتيرية هي أفضل المضاعفات المعترف بها من استئصال الطحال4,5. في الاونه الاخيره ، تم الاعتراف بالإنتان الساحق بعد استئصال الطحال كمضاعفات مكثفه لاستئصال الطحال المرتبطة بارتفاع معدل الوفاات6. وعلاوة علي ذلك ، تشير الدراسات الوبائية الاخيره إلى ان استئصال الطحال قد تترافق مع حدوث امراض القلب والاوعيه الدموية ، مما يوحي بان المزيد من الوظائف الفسيولوجية من الطحال لا تزال لاستكشاف7،8.
وقد استخدمت كل من زرع الطحال الذاتي وزراعه الطحال في العيادة. حاليا ، الطحال زرع الذاتي من خلال زرع الأجزاء من الانسجه الطحال في الحقائب التي تم إنشاؤها في مينوتوم أكبر يعتبر الامكانيه الوحيدة للحفاظ علي وظيفة الطحال بعد الصدمة استئصال الطحال9،10. ومع ذلك ، فان فعاليه هذه الجراحة قابله للنقاش كمضاعفات ما بعد الجراحة مثل نخر العقيم للانسجه الطحال وانسداد الأمعاء الدقيقة بسبب التصاقات بعد العملية الجراحية يمكن ان تحدث11. وتشارك زراعه الطحال في زرع متعدد الأحشاء12. تشير الادله السريرية من الزرع المتعدد الأحشاء إلى ان زراعه الطحال قد تلعب دورا وقائيا في رفض الكسب غير المزروع بالأمعاء الصغيرة دون التسبب في مرض الطعم مقابل المضيف (GVHD)12. ومع ذلك ، لا تزال الأدبيات المتعلقة بالتاثير المفيد لزراعه الطحال كمكون للزرع المتعدد الأحشاء محدوده ولا تزال أليات الاساسيه التي يتعين تحديدها. وفي ال2006 ، ذكر ياير راتنر وآخرون ان زرع انسجه الطحال الجنينية التي لا توجد بها خلايا تائية للفئران يمكن ان يشفي الاصابه بالشلل النصفي A ، وهو مرض وراثي دون ان يسبب GVHD13، ودعم ان زرع الطحال يحمل وعدا علاجيا في بعض الامراض. لذلك ، هناك حاجه لمزيد من التحقيقات حول الإمكانيات العلاجية لزراعه الطحال.
النماذج الحيوانية من زرع الطحال هي قيمه لاستكشاف وظيفة غير مقدره من الخلايا المناعية المستمدة من الطحال في تطور المرض وكذلك لاختبار التاثير العلاجي المحتمل لزرع الطحال. تم توثيق نماذج زراعه الطحال الكاملة التجريبية منذ أوائل القرن العشرين ، كما استعرضها كوهين14. في 1969, coburn ريتشارد j. ولي et al. مفصله تقنيه زرع الطحال في الفئران15,16. وفي الاونه الاخيره ، وصفت الدوامات FK وآخرون نموذج الماوس لزرع الطحال17. بالمقارنة مع نماذج الفئران ، نماذج الفار من زرع الطحال هي أكثر جاذبيه بسبب العديد من المزايا المتاصله. علي سبيل المثال ، من خلال استخدام نموذج الماوس ، يمكننا الوصول إلى مجموعه واسعه من الكواشف غير متوفرة لتلك النماذج الفئران. وعلاوة علي ذلك ، باستخدام الفئران الجينية (علي سبيل المثال ، الفئران مع CD 45.1/CD 45.2 الخلفية) ، وزرع الطحال synجينه يجعل من الممكن لتتبع مصير ، وطول العمر ، ووظيفة الطحال18. استنادا إلى العمل الذي تقوم به الدوامات FK وآخرون17، انشانا كذلك هذا البروتوكول المبسط والمعزز لزرع الطحال في الفئران. يجمع البروتوكول الموصوف أدناه بين الموثوقيه والجدوى بطريقه موحده ويمكن استخدامه كاداه لدراسة بيولوجيا الطحال ومناعة الزرع.
Protocol
Representative Results
Discussion
أدله دامغه تشير إلى ان الخلايا الاحاديه المستمدة من الطحال تلعب دورا هاما في العمليات التهابيه العقيمة مثل تصلب الشرايين19, الدماغ نقص التروية الحاد20 أو أصابه الرئة18, وكذلك عضله القلب I/R أصابه أعاده عرض21,22,<sup class="…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون المركز الشامل لزراعه الكليات في جامعه نورث وسترن وبرنامج مدرسه فاينبرغ للبحوث الطبية لدعم الموارد والتمويل. علي وجه التحديد, تدفق الخلوي والانسجه الخدمات التي قدمتها جامعه نورث وسترن التدفق الخلوي الاساسيه مرفق والماوس الانسجه ومختبر التنميط, علي التوالي, ويدعم كل منها من قبل P30 CA060553 منحت لروبرت H مركز لوري الشامل للسرطان. نشكر السيد نيت اسبارزا علي تصحيح هذه المخطوطة.
Materials
| Ketamine | Wyeth | 206205-01 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | |
| Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Injection grade normal saline | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-20 | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc. | 111000140 | |
| ThermoCare Small Animal ICU System | Thermocare, Inc. | ||
| Adson Forceps | Roboz Surgical Instruments | RS-5230 | |
| Derf Needle Holder | Roboz Surgical Instruments | RS-7822 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instruments | RS-5881 | |
| Micro-clip | Roboz Surgical Instruments | RS-5420 | |
| 7-0 silk | Braintree Scientific | SUT-S 103 | |
| 11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle | Sharpoint DR4 | AK-2119 | |
| Ms CD45.2 antibody | BD Bioscience | 553772 | |
| Ms CD45.1 antibody | BD Bioscience | 553776 | |
| Ms CD11b antibody | BD Bioscience | 557657 | |
| Ms B220 antibody | BD Bioscience | 553089 | |
| Ms Ly6C antibody | eBioscience | 48-5932-80 | |
| Ms Ly6G antibody | BD Bioscience | 561236 | |
| Ms F4/80 antibody | BD Bioscience | 565614 | |
| Ms CD11c antibody | BD Bioscience | 558079 | |
| Ms CD3 antibody | eBioscience | 48-0032-82 | |
| Ms CD4 antibody | BD Bioscience | 552051 | |
| Ms CD8 antibody | BD Bioscience | 563786 | |
| LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L34955 |
Referenzen
- Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34 (5), 455-465 (2006).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9 (9), 428-437 (2017).
- Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99 (2), 392-398 (2014).
- Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95 (48), e5098 (2016).
- Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome – review study. International Journal of Surgery. 12 (12), 1314-1316 (2014).
- Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy – a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102 (8), 1333-1341 (2017).
- Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114 (14), 2861-2868 (2009).
- Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19 (2), 156-161 (2012).
- Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78 (3), 270-278 (1991).
- Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73 (2), 83-86 (1991).
- Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246 (3), 436-444 (2007).
- Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (50), 19075-19080 (2006).
- Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69 (6), 777-784 (1954).
- Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8 (1), 86-88 (1969).
- Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65 (3), 436-439 (1969).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325 (5940), 612-616 (2009).
- Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2833-2847 (2018).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
- Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), 1411-1419 (2014).
- Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39 (5), 806-818 (2013).
- Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18 (2), 1470320317706653 (2017).
- Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 62 (2016).
- Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200 (6), 1982-1987 (2018).
