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Immunologie und Infektion

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

Published: May 11, 2020
doi:
10.3791/59641
,
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus,Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Ici, nous décrivons une immunocapture indirecte de sandwich d’ELISA pour déterminer le contenu immunogénique de glycoprotéine dans les vaccins de rage. Ce test utilise un anticorps monoclonal neutralisant (mAb-D1) reconnaissant les garnitures de glycoprotéine. Il s’agit d’une alternative au test in vivo NIH pour suivre la cohérence de la puissance vaccinale pendant la production.

Abstract

La préoccupation mondiale croissante pour le bien-être animal encourage les fabricants et les Laboratoires nationaux de contrôle (OMCLs) à suivre la stratégie 3R pour le remplacement, la réduction et le raffinement des tests de laboratoire sur les animaux. Le développement d’approches in vitro est recommandé aux niveaux de l’OMS et de l’Europe comme solutions de rechange au test des NIH pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage. À la surface de la particule du virus de la rage (RABV), les garnitures de glycoprotéine constituent l’immunogène majeur pour induire des anticorps neutralisants viraux (VNAb). Un test ELISA, où neutraliser les anticorps monoclonals (mAb-D1) reconnaître la forme trimétérique de la glycoprotéine, a été développé pour déterminer le contenu de la glycoprotéine trimérique pliée indigène avec la production des lots vaccinaux. Ce test de puissance in vitro a démontré une bonne concordance avec le test des NIH et a été jugé approprié dans les essais collaboratifs par les fabricants de vaccins RABV et les OMCLs. L’évitement de l’utilisation des animaux est un objectif réalisable dans un proche avenir.

La méthode présentée est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant le mAb-D1 qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabV trimeric, c’est-à-dire, l’antigène immunogénique RABV. mAb-D1 est utilisé pour le revêtement et la détection des garnitures de glycoprotéine présentes dans le lot vaccinal. Puisque l’épitope est reconnue en raison de ses propriétés conformationnelles, la glycoprotéine potentiellement dénaturée (moins immunogène) ne peut pas être capturée et détectée par le mAb-D1. Le vaccin à tester est incubé dans une plaque sensibilisée au mAb-D1. Les glycoprotéines rabV trimeric bound sont identifiées en ajoutant le mAb-D1 encore, étiqueté avec le peroxidase et puis révélé en présence de substrat et de chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique.

Introduction

Depuis plus de 50 ans, le test1 des NIH est utilisé comme méthode de référence pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage avant la libération du lot. Ce test consiste en une vaccination intrapétoninenelle de groupes de souris avec le vaccin à tester suivie d’un défi intra-cérébral (IC) 14 jours plus tard avec la souche Challenge Virus Standard (CVS) du virus de la rage (RABV). La puissance est évaluée à partir de la proportion de souris survivant au défi IC. Bien que l’OMS2 et la pharmacopée européenne3 nécessitent toujours le test niSH pour évaluer la puissance vaccinale, ce test subit plusieurs obstacles : les résultats sont très variables4; LE RABV infectieux est utilisé pendant le défi, ce qui exige à la fois des compétences techniques et des mesures de biosécurité strictes; un grand nombre d’animaux sont utilisés, et la gravité du défi soulève de sérieuses préoccupations éthiques5. Une variation moins grave de ce test a été développée : deux semaines après la vaccination intra-péritonéale, les souris ne sont pas contestées par IC mais saignées et testées pour la présence d’anticorps neutralisant RABV spécifiques (VNAbs) dans leur sérum à l’aide d’un test de neutralisation in vitro. Cependant, ce test nécessite encore de sacrifier un grand nombre de souris de laboratoire, bien qu’il soit déjà utilisé pour les vaccins vétérinaires6,7 et a été considéré pour les vaccins humains8.

À l’heure actuelle, les recommandations internationales9 et européennes10 encouragent les fabricants et les laboratoires nationaux de contrôle (Laboratoires officiels de contrôle des médicaments – OMCL) à mettre en œuvre le remplacement, la réduction et le raffinement des essais sur les animaux de laboratoire, appelé la stratégie 3R. La directive européenne 2010/63/UE (en vigueur depuis 2013/01/01) relative à la protection et au bien-être des animaux a également renforcé les contraintes pour les fabricants de vaccins et les laboratoires impliqués dans le contrôle de la qualité des vaccins antirabiques ainsi que dans la recherche sur la rage11. En conséquence, le développement, la validation et l’utilisation d’approches in vitro alternatives sont maintenant devenus une priorité. Ceux-ci sont non seulement éthiquement sains, mais peuvent également réduire les coûts de test par lots et raccourcir le temps pour les résultats à des heures au lieu de semaines3.

À la surface de la particule RABV, la glycoprotéine adopte une forme trimétérique12,13,14,15,16. Dans le vaccin contre la rage, cette forme trimériique indigène constitue l’immunogène majeur induisant VNAbs17 tandis que les glycoprotéines monomériques, solubles ou dénaturées sont mal immunogéniques18,19. Ainsi, la préservation des garnitures de la glycoprotéine le long du processus de production du vaccin est un bon indicateur pour la préservation d’un potentiel immunogène optimal. Plusieurs méthodes immunochimiques, telles que l’anticorps-contraignant-test20,21, letest d’immunodiffusion radiale unique (SRD) et le test ELISA23,24,25,26,27 sont recommandés par le rapport technique de l’OMS Série2 et la monographie européenne3 pour quantifier la teneur en antigènes dans les vaccins contre la rage. Ceux-ci sont utilisés par les fabricants pour surveiller l’uniformité de la production de vaccins et par l’OMCL pour évaluer la formulation cohérente de lots de vaccins humains28, même si le test des NIH est toujours considéré pour la puissance.

Cependant, toutes ces méthodes immunochimiques ne sont pas équivalentes. Le test SRD nécessite un pré-traitement qui peut modifier les garnitures à la membrane et entraîner une forme soluble ou dénaturée de la glycoprotéine22,29. Par conséquent, SRD n’est pas très efficace en discriminant entre les glycoprotéines immunogéniques et non immunogènes résultant en une évaluation imparfaite de l’immunogénicité d’un lot vaccinal. En revanche, le test ELISA est plus sensible22, préserve la structure indigène de la glycoprotéine, et est plus approprié pour déterminer le contenu des garnitures pliées indigènes de glycoprotéine. Le test ELISA peut utiliser soit des anticorps anti-glycoprotéines monoclonals de lapin ou de souris purifiés ou concentrés avec du sulfate d’ammonium. Des études ont démontré une bonne concordance entre le test des NIH et le contenu antigène évalué par ELISA dans les vaccins et ont conclu que les méthodes ELISA conviennent au test de puissance in vitro. Cela préconise que les tests ELISA pourraient au moins compléter ou même remplacer le test des NIH4,26,27,30,31,32,33. Aujourd’hui, la Pharmacopoeia européenne recommande l’utilisation d’essais sérologiques ou immunochimiques validés comme alternatives au test des NIH3. L’évitement complet de l’utilisation animale de la puissance vaccinale est devenu une perspective réaliste.

La méthode présentée ci-dessous est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant un clone d’anticorps monoclonal de souris (mAb-D1) qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabVtrimeric 15,34. Cette méthode a d’abord été développée à l’Institut Pasteur26,30 puis optimisée et validée par le laboratoire de l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), c’est-à-dire le Français OMCL4,33. Le mAb-D1 est utilisé à la fois pour sensibiliser la plaque et par la suite pour détecter l’antigène capturé. Cela permet la quantification spécifique des garnitures de glycoprotéine, c’est-à-dire l’antigène RABV immunogénique. Le mAb-D1 utilisé pour la détection est étiqueté avec peroxidase, qui se révèle en présence du substrat et du chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique. Il est à noter que le même type d’essai peut être appliqué pour différents mAbs reconnaissant différents sites antigéniques de la glycoprotéine RABV35. La méthode pour obtenir et purifier ou se concentrer avec l’ammonium sulfate anti-glycorotein polyclonal rabbit immunoglobulins G (IgG) ou globulines monoclonal de souris ont été largement décrits précédemment36 avec la méthode pour conjuguer des anticorps avec peroxidase37.

Protocol

1. Précautions de sécurité REMARQUE : Cette méthode s’applique à la fois au RABV vivant et au vaccin inactivé. Utilisez de bonnes procédures de pratique et de sécurité en laboratoire. Portez un équipement de protection personnelle (EPI) adéquat, y compris un manteau jetable, des gants, un masque, des lunettes, etc. Lorsque le virus vivant est titré, utilisez un coffret biologique de sécurité de classe II. Considérez tout matériau en conta…

Representative Results

Dans l’exemple suivant, le vaccin de référence Lot 09, composé de particules purifiées du virus de la rage inactivée (souche vaccinale photovoltaïque), est utilisé. La teneur en glycoprotéines (10 g/ml) a été établie après la détermination de la quantité totale de protéines virales (test BCA) et l’évaluation du pourcentage de glycoprotéine par l’électrophoresis du gel SDS-polyacrylamide. Alternativement, un vaccin de référence calibré, par exemple, la norme…

Discussion

L’épitope reconnu par le mAb-D1 est situé dans le site antigénique III de la glycoprotéine RABV qui est non seulement immuno-dominant pour l’induction de VNAbs, mais aussi impliqué dans la neurovirulence, la pathogène40,41 et la reconnaissance des récepteurs42. Il ya un autre site antigénique important le long de la glycoprotéine, site II43, contre lequel plusieurs MAbs ont été isolés tels que mAb-WI…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La Dre Sylvie Morgeaux et le Dr Jean-Michel Chapsal doivent être reconnus pour leur participation clé à l’établissement de l’analyse ELISA sur les lots de vaccins et à l’organisation d’ateliers internationaux et d’études collaboratives. Nous remercions Sabrina Kali pour la lecture critique du manuscrit. Le Dr Pierre Perrin était responsable de l’isolement et de la caractérisation de mAb-D1. Ce travail a été principalement soutenu par le financement de l’Institut Pasteur.

Materials

Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880
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Referenzen

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Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).
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