PDMS 기반의 제조 과정, 다층, 체외 전사 및 번역(IVTT) 반응이 장기간 수행될 수 있도록 하는 미세유체 장치. 또한 장기간 이러한 반응을 자동화하고 유지하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어에 대한 포괄적인 개요가 제공됩니다.
세포 기지를 둔 합성 생물학의 한계는 연구원이 더 크고 더 복잡한 합성 유전 통제 회로를 개발하는 것을 목표로 함에 따라 점점 더 명백해지고 있습니다. 생체 내에서 합성 유전 조절 네트워크의 분석은 시간이 많이 걸리고 환경 제어의 부족으로 고통받고 있으며, 외인성 합성 성분이 호스트 프로세스와 상호 작용하여 원치 않는 행동을 초래합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 새로운 회로의 무세포 특성화가 더욱 널리 퍼지고 있습니다. 시험관 내 전사 및 번역(IVTT) 혼합물은 실험 환경의 조절을 허용하고 각각의 고유 시스템에 최적화될 수 있다. 여기에 제시된 프로토콜은 장기간 IVTT 반응을 유지하는 데 사용할 수 있는 다층 미세 유체 장치의 제조를 자세히 설명합니다. 시간이 지남에 따라 자원이 고갈되고 (바이-) 제품이 축적되는 배치 반응과는 달리, 미세 유체 장치를 사용하면 자원의 보충뿐만 아니라 반응 제품의 제거가 가능합니다. 이러한 방식으로, 세포 환경은 유전자 회로의 동적 거동이 장기간에 걸쳐 조사될 수 있는 평형 이외 환경을 유지함으로써 에뮬레이트된다. 다층 미세 유체 장치를 완전히 활용하기 위해 하드웨어와 소프트웨어가 통합되어 IVTT 반응을 자동화합니다. IVTT 반응을 여기에 제시된 미세 유체 플랫폼과 결합함으로써 복잡한 네트워크 동작을 포괄적으로 분석하여 세포 프로세스를 조절하는 메커니즘에 대한 이해를 촉진할 수 있습니다.
셀은 복잡한 동적 규제 네트워크1,2를사용하여 환경을 감지하고 대응할 수 있습니다. 합성 생물학 분야는 세포3,4의기능을 확장 할 수있는 생물학적 시스템을 설계하기 위해 이러한 네트워크를 포함하는 자연 발생 구성 요소에 대한 우리의 지식을 활용합니다. 반대로, 기존 회로의 단순화된 합성 유사체를 설계하거나 자연적으로 발생하는 행동을 나타내는 전방 공학 생물 시스템을 설계하여 생명을 지배하는 자연 네트워크에 대한 이해를 증진할 수도 있습니다. 이러한 생물학적 시스템의 de novo 엔지니어링은 새로운 유전 회로 또는 신호 경로가 잘 정의 된5,6부분을 사용하여 합리적인 방식으로 설계되는 상향식 방식으로 수행됩니다. 네트워크의 합리적인 설계와 생물학적 관련 시스템의 설계를 결합하면 다양한 수준의 추상화 7과 함께 생물학적 규제 시스템의 심층적 특성화 및 연구를 할 수있습니다.
Elowitz와 Leibler8 및 Gardner et al.9의 선구적인 작품은 세포 호스트에 합성 유전 네트워크의 성공적인 도입을 입증하는 첫번째이었습니다. 다음 10 년 에서, 수많은 연구원은세포7,10,11에 합성 회로의 도입에 관한 몇 가지 제한의 출현에도 불구하고 이러한 초기 성공에 구축을 계속하고있다 ,12. 이상적으로, 셀룰러 호스트에 합성 회로의 도입은 모듈 식으로 발생해야합니다. 불행하게도, 셀룰러 환경의 복잡성은 많은 부분과 네트워크의 기능이 매우 문맥의존되는 12,13,14,특히 도전하게한다 . 결과적으로 네트워크는 종종 합성 회로의 기능에 영향을 줄 수 있는 네이티브 호스트 구성 요소와 원치 않는 상호 작용을 경험합니다. 유사하게, 외인성 네트워크의 구성 요소는 숙주 과정을 억제하고, 호스트 내의 공유 자원을 위해 경쟁하고, 성장역학15,16,17에영향을 미칠 수 있다. 따라서 생체 내 환경에서 합성 네트워크의 동작을 합리적으로 설계하고 예측하기 위해서는 모든 호스트 및 회로 별 역학의 포괄적인 모델이필요합니다 18.
합성 네트워크의 특성화를 위한 셀룰러 호스트의 사용에 대한 실행 가능한 대안은 시험관 내 전사 및 번역(IVTT) 기술의 적용이다. 합성 망에 대한 테스트베드로서 작용하여, 반응은 유전자 발현을 가능하게 하는 데 필요한 모든 성분을 포함하는 용액에서수행된다(19,20,21). 이러한 방식으로, 생물학적으로 관련, 이기는하지만 인공, 환경은 합성 네트워크를 테스트 할 수있는 내에서 생성된다22,23,24,25, 26, 27,28. IVTT 솔루션을 사용하는 주요 장점은 사용자가 지정한 조건하에서 반응을 수행할 수 있는 능력이며, 연구자들은 각 반응의 정확한 조성을 조정할 수 있습니다2. 또한 셀 프리 접근 방식은 시간이 많이 소요되는 셀룰러 복제 단계를 수행할 필요가 없으므로 합성 네트워크의 높은 처리량 테스트를 가능하게 합니다. 그 결과, 연속적인 설계 -build-test 사이클의 지속 기간은29,30,31,32로현저히 감소된다. Gibson 어셈블리와 같은 무세포 복제 기술을 활용하여 새로운 네트워크를 신속하게 엔지니어링하고 생체 내 테스트에 필요한 플라스미드와 달리 선형 DNA 템플릿에서 네트워크를 구축함으로써 설계 주기를 더욱 가속화할 수 있습니다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR)33,34를통해 증폭 될 수있다.
배치 반응은 IVTT 반응이 수행 될 수있는 가장 간단한 방법이며, 모든 반응 성분이 결합되는 것을 특징으로하는 단일 반응 용기가필요합니다 35. 이러한 반응은 단백질 발현 및 기본 회로 테스트에 충분하지만 네트워크의 장기적인 동적 거동을 연구하려고 할 때 불충분하다는 것을 증명합니다. 배치 반응의 과정을 통해, 시약은 고갈되거나 전사 및 번역 속도의 지속적인 감소의 결과로 저하를 겪습니다. 또한 반응이 진행됨에 따라 네트워크의 올바른 기능을 방해하거나 완전히 억제할 수 있는 부산물이 축적됩니다. 궁극적으로, 배치 반응기의 사용은 관찰 할 수있는 동적 동작을 제한, 부정적인 규제는5,36을구현하는 특히 도전되고.
IVTT 시스템의 다양성은 연속 흐름에서 액적 기반 방법뿐만 아니라 간단한 투석 접근법 2,30에이르기까지 장기간 IVTT 반응을 수행 할 수있는 여러 가지 대체 방법을 가능하게합니다. 37,38,39,40. 미세 유체 장치의 응용 프로그램은 처리량을 증가시키고 비용을 최소화하는 동안 사용자가 자신의 반응에 대한 제어를 증가 제공35,41,42,각 특정 접근 방식은 자신의 장점. 연속 흐름의 사용은 발현 수율을 증가시키기 위해 용이하게 최적화될 수 있지만, 특정 반응 생성물을 효과적으로 제거할 수 없다는 것은 동적 거동에 대한 연구를 사소한39로만든다. 액적 기반 미세유체 시스템을 채용하는 동안 신규 네트워크의 고처리량 스크리닝이 가능하지만, 반응에 신선한 시약을 공급하는 어려움은 소량의 배치반응(43)과유사한 액적의 결과를 초래한다. 투석 기지를 둔 반응기는 신선한 시약의 소개를 허용할 뿐만 아니라 몇몇 반응 제품의 제거, RNA 분자 및 더 큰 단백질은 막 기공을 통해서 확산하기에 는 너무 크고, 반응기 내축적입니다. 또한, 시약의 많은 볼륨은 장기간 이러한 반응을 유지하기 위해 필요합니다30,44. 2013년, Maerkl 등은 장기간 IVTT 반응을 수행하기 위해 특별히 설계된 다층 미세 유체 장치를36,45로제시하였다. 다층 미세 유체 장치의 사용은 유체 흐름을 직접 제어 할 수 있게하여 장치46,47의특정 영역에서 유체의 리디렉션및 유체 의 절연을 허용합니다. 이러한 단리된 영역은 IVTT 반응이 수행될 수 있는 독립적인 나노리터 규모의 반응 챔버로서 기능할 수 있다. 단일 IVTT 반응 의 과정을 통해, 반응기에 신선한 시약의 주기적인 주사는 IVTT 분대 및 DNA 템플릿을 보충하기 위하여 이용됩니다. 동시에, 이전 반응 용액의 동일한 부피가 변위되어 반응 제품을 제거합니다. 이러한 방식으로, 기초 전사 및 번역 속도가 일정한 상태로 유지되는 평형 환경이 유지되어 IVTT 반응의 수명을 연장하고 풍부한 동적 동작이 발생할 수 있습니다. 이 접근을 적용함으로써, 연구원은 새로운 유전 네트워크의 전진 공학에 있는 원조, 특정 회로 내의 일어나는 개별적인 프로세스의 운동 비율을 조사할 수 있습니다. 예를 들어, Niederholtmeyer 외. 유전 링 발진기의 다양한 요소를 특성화하기 위해 이 접근법을 구현하고, 이의 운동 속도를결정한다 36. 추가 연구에서 Yelleswarapu 외. 배치 조건하에서 결정된 시그마 인자 28(σ28)의운동 속도가 σ28기반 발진기의 거동을 설명하기에 충분하지 않았으며, 유동 기반 데이터의 첨가가 불충분하다는 것을 보여주었다. 네트워크 동작의 향상된 모델 예측22.
이 원고의 목적은 장기 IVTT 반응을 수행 할 수있는 다층 미세 유체 장치의 제조를위한 완전한 프로토콜을 제시하는 것입니다. 또한 이 원고는 장기간 IVTT 반응을 수행하는 데 필요한 모든 하드웨어 및 소프트웨어를 설명합니다. 그 안에 유체의 흐름을 제어하는 데 필요한 미세 유체 장치의 작동은 튜브 길이를 통해 미세 유체 장치에 직접 연결되는 일련의 공압 밸브를 사용하여 달성됩니다. 또한 공압 밸브는 맞춤형 가상 제어 인터페이스를 통해 제어됩니다. 미세 유체 장치 내의 유체 흐름은 시판되는 압력 조절 시스템에서 제공하는 연속 압력을 사용하여 달성됩니다. IVTT 반응은 전형적으로 29°C와 37°C 사이에서 수행되며 현미경 인큐베이터는 반응 동안 온도를 조절하는데 사용된다. 그러나 IVTT 혼합물의 기능은 4°C 이상으로 저장될 때 점차 저하된다. 따라서, 이 원고는 미세 유체 장치에 주입하기 전에 IVTT 혼합물을 냉각하는 데 사용되는 오프 칩 냉각 시스템에서 확장됩니다. 결론적으로,이 원고는 다른 연구자들이 상대적으로이 기술을 복제 할 수 있도록 미세 유체 흐름 반응기를 사용하여 장기간 IVTT 반응을 성공적으로 수행하는 데 필요한 절차에 대한 포괄적 인 개요를 제공합니다. 용이성.
PDMS 기반 다층 미세 유체 장치가 제시되었으며, 오랜 시간 동안 IVTT 반응을 유지하는 능력이 입증되었습니다. 이 특정 예제에 적합하지만 이 기술은 다른 수많은 응용 프로그램에 사용될 수 있습니다. 유체 흐름에 대한 추가 제어 – (by) 제품을 제거하는 동안 지속적으로 반응 시약을 보충할 수있는 능력과 결합 – 연속 합성 반응, 다양한 동적 행동의 조사 및 동시 단일 반응의 여러 변형의 전도.
PDMS 기반 장치의 비교적 간단한 제작 과정에도 불구하고, 이의 사용은 광범위한 하드웨어 설정이 필요합니다. 밸브 어레이, 압력 조절기, 압력 펌프, 인큐베이터 및 냉각 장치로 구성된 제작에서 사용으로의 전환은 기본이 아니며 상당한 초기 투자가 필요합니다. 또한 이러한 장치로 성공적인 실험을 일관되게 설정하고 수행할 수 있는 능력은 상당한 시간 투자가 필요합니다. 이 원고가 해결하는 것을 목표로하는 지점입니다. 그러나 일단 제자리에 있으면 전체 설정을 다양한 용도로 수정할 수 있습니다. 또한 하드웨어 설정은 수많은 모듈식 요소로 구성되며, 각 요소는 보다 복잡한 미세 유체 장치 설계를 사용할 수 있도록 확장할 수 있습니다. 또한, 모듈식 설계를 통해 하드웨어 구성요소를 유사하게 작동하는 대안으로 교체할 수 있으며, 이러한 대안은 사용자가 여기에 설명된 특정 설정에 한정되지 않도록하는 48,49.
개별 장치 간의 가변성 및 외부 조건(예: 압력 변동)에서는 이러한 장치를 사용하여 실험을 수행할 때 부정확성이 발생할 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 각 실험 전에 시스템 교정을 수행하여 각 반응기마다 고유한 새로 고침 비율을 제공해야 합니다. 교정은 장치 간 및 실험 간 변형을 해결하는 반면, 시간이 많이 소요되는 프로세스이며 완벽하지 않습니다. 점도가 다른 유체는 동일한 압력에 노출될 때 동일한 속도로 흐르지 않으며, 다중 시약으로 교정을 수행하므로 동일한 새로 고침 비율을생성하지 않을 수있습니다. 이 효과는 공급된 압력만 을 변화시켜 흐름을 조절하는 것과 는 달리 세 가지 제어 채널을 사용하여 시약을 미세 유체 장치로 연동 펌프하여 감쇠됩니다. 점도의 차이가 매우 큰 경우 마지막 수단으로, 여러 교정 실험을 수행하여 각 개별 시약에 대해 고유한 새로 고침 비율을 구현할 수 있습니다.
연동 펌프를 사용하여 미세 유체 장치에 시약을 주입하면 점도가 다른 솔루션을 사용하는 효과가 약해지지만 이차적인 문제도 발생합니다. 유체를 미세 유체 장치로 펌핑하기 위해 개별 단계를 사용하면 단일 반응기로 의 주입 해상도가 제한되고 단일 펌프 사이클을 수행할 때 주입된 부피에 의해 제한됩니다. 우리의 연구 내에서 이 값은 보정 중에 결정되며, 단일 펌프 사이클이 반응기 부피(약 0.1 nL)의 약 1%를 대체한다는 것을 나타냅니다. 따라서 반응기 부피의 30%를 대체하려면 30개의 펌프 사이클을 실행해야 하며, IVTT 반응 용액의 23개의 펌프 사이클이 추가되고 DNA 또는 초순수의 펌프 사이클만 7회가 추가됩니다. 연구에 충분하지만 대체 실험 프로토콜은 더 많은 수의 고유 시약을 추가하거나, 더 낮은 새로 고침 분획을사용하거나, 반응기에 단일 시약의 더 작은 볼륨을 추가하려고 할 때 문제가 발생할 수 있습니다. 이러한 경우, 미세 유체 장치 설계는 더 큰 부피의 반응기를 제공하도록 조정할 수 있다. 이러한 예는 니더홀트마이어 외36에보고됩니다.
결정적으로, 이 원고에 설명된 장치는 장기간 반응을 지속하여 정상 상태 전사 및 번역 속도를 가능하게 합니다. 주기적으로 반응기에 새로운 시약을 주입하고 반응(byby)제품을 제거함으로써 반응이 지속되고 복잡한 동적 거동을 모니터링할 수 있습니다. 이런 식으로 어느 정도는 셀룰러 환경을 모방하는 플랫폼이 만들어졌습니다. 또한,이 플랫폼은 주사와 주사의 특정 구성 사이의 기간을 조정하여 시스템 역학의 탐구를 가능하게한다. 그 결과, 이러한 다층 미세 유체 장치는 복잡한 동적 동작을 표시하는 새로운 합성 네트워크의 특성화 및 최적화를 위한 강력한 도구입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 유럽 연구위원회에 의해 지원되었다, ERC (프로젝트 n. 677313 BioCircuit) 과학 연구를위한 네덜란드 기구에서 NWO-VIDI 교부금 (NWO, 723.016.003), 교육부에서 자금 지원, 문화 및 과학 (중력) 프로그램, 024.001.035 & 024.003.013), 인간 프론티어 과학 프로그램 그랜트 RGP0032/2015, 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 그랜트 723106, 스위스 국립 과학 재단 보조금 200021_182019.
Reagents | |||
Acetone | VWR | 20063.365 | |
AZ 40 XT | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Positive Photoresist |
AZ 726 MIF Developer | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Developer Positive Photoresist |
Isopropanol | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
Microscope slides | VWR | ECN 631-1550 | |
mr Dev 600 | Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) | – | Developer Negative Photoresist |
Silicon Free Heat Sink Grease | Circuit Works | CW7270 | Thermal Compound |
Silicon wafers | Silicon Materials | – | <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness |
SU-8 3050 | Microchem Corp. (Newton, MA) | – | Negative Photoresist |
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) | The Dow Chemical Company | 01317318 | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
4 channel digital input/output module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-504 | 8x |
Camera lens | The Imaging Source | – | |
Compression fitting | Koolance, Inc. | FIT-V06X10 | Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x |
Controller end module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-600 | |
Device connecting tubing | Saint-Gobain Performance Plastics | AAD04103 | 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80) |
Device connector pins | Unimed SA (Lausanne, Switserland) | 200.010-A | AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L |
Ethernet Controller | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-881 | |
Female bus connector | Encitech | DTCK15-DBS-K | 15 pole female bus connector |
Fluid reservoirs | Fluigent | Fluiwell-4C | |
Fluigent pressure system | Fluigent | MFCS-EZ | 0 – 345 mbar |
Hg short arc lamp | Advanced Radiation Corporation | – | 350W |
Hot plate | Torrey Pines Scientific | HP61 | |
Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-E | |
LabVIEW Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Liquid coolant | Koolance, Inc. | LIQ-705CL-B | |
Luer stubs | Instech Laboratories, Inc. | LS23 | |
Male Luer to barb connectors | Cole Parmer | 45505-32 | 3/32" ID |
Matlab Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Microcamera | The Imaging Source | DMK 42AUC03 | |
Microscope camera | Hamamatsu Photonics | OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU) | |
Orbital shaker | Cole Parmer | EW-513000-05 | |
Oven | Thermo Scientific | Heraeus T6P 50045757 | |
Oxygen plasma asher | Quorum Technologies | K1050X | |
PDMS puncher | SYNEO | Accu-Pucnh MP10 | |
PEEK tubing | Trajan | 1301005001-5F | 0.005" ID, 1/32" OD, Red |
Peltier element | European Thermodynamics | APH-127-10-25-S | |
Peltier temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | |
Photomask | CAD/Art Services, Inc. | – | |
Photomask Design | Maerkl Lab, EPFL | https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ | |
Pneumatic valve array | FESTO | – | 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves. |
Power adapter | Koolance, Inc. | ADT-EX004S | 110/220V AC Power Adapter |
PTFE tubing | Cole Parmer | 06417-21 | #24 AWG Thin Wall PTFE |
Punching pin | SYNEO | CR0320245N21R4 | OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm) |
PVC Tubing | Koolance, Inc. | HOS-06CL | 6 mm ID, 10 mm OD |
Single edge blades | GEM Scientific | – | |
Soft tubing | Fluigent | – | Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD) |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | WS-650MZ-23NPPB | |
Stereo microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
Thermistor cable | Warner Instruments | TA-29 | Cable with bead thermistor |
UV exposure system | ABM, USA | – | Near UV Exposure System, 350W |
Vacuum pump | Vacuumbrand GmbH | MD1C | |
Water cooled cold plate block | Koolance, Inc. | PLT-UN40F | |
Water cooler | Koolance, Inc. | EX2-755 | |
Weighing scales | Sartorius | M-prove |