돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어
Summary
다음 절차는 유전자 조작 된 마우스 모델을 사용 하 여 뮤 린 등 피부에 멜 라 세포 종양 개시의 공간적 및 시간적 제어를 위한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 거시적 뿐만 아니라 현미경 피부 흑색 종 개시를 설명 합니다.
Abstract
피부 흑색 종은 가장 공격적인 피부 암으로 잘 알려져 있습니다. 비록 위험 요인과 주요 유전 변화는 계속 해 서 증가 하는 깊이로 문서화 될 수 있지만, 피부 흑색 종의 발병 률은 최근 수십 년 동안 급속 하 고 지속적인 증가를 보이고 있다. 효과적인 예방 방법을 찾기 위해, 피부에 흑색 종 개시의 초기 단계를 이해 하는 것이 중요 합니다. 이전 데이터는 종양 생성 돌연변이 및 유전적 변경을 발현 할 때 성체 피부 조직에서 여 포 멜 라 닌 세포 (MCSCs)가 원산지의 흑색 종 세포로 작용할 수 있다는 것을 입증 하였다. 흑색 종에 걸리기 쉬운 MCSCs에서 발생 하는 종양은 대기에서 활성 상태로의 MCSCs 전이로 인해 유발 될 수 있다. 흑색 종 발생 가능한 MCSCs에서의 이러한 전환은 모 낭 줄기 세포의 활성 상태 또는 자외선-b와 같은 외적 환경적 요인을 통해 어느 하나의 변조에 의해 촉진 될 수 있다. 이러한 요인은 화학 탈모에 의해 실험실에서 인위적으로 조작 될 수 있으며,이는 모 낭 줄기 세포와 MCSCs를 정 동작 상태에서 활성 상태로, 그리고 벤치탑 광을 사용 하 여 UV-B 노출로 전환 시키는 원인이 됩니다. 이 방법 뮤 린 등 쪽 피부에 있는 피부 흑색 종 개시의 성공적인 공간 그리고 시간적 통제를 제공 합니다. 따라서, 이러한 생체 내 모델 시스템은 피부 흑색 종 개시의 초기 단계를 정의 하 고 종양 예방을 위한 잠재적인 방법을 시험 하는데 사용 될 수 있는 가치가 있을 것 이다.
Introduction
흑색 종, 멜 라 세포 종양의 악성 형태는 대부분의 피부 암 사망1을 담당 하는 피부 흑색 종으로 피부의 가장 공격적인 암입니다. 미국에서, 흑색 종은 일반적으로 진단 됩니다; 20182에서 추정 된 새로운 암 발병 사례 중 5th 내지 6번째 가장 흔한 암 유형으로 예상 된다. 더욱이, 전반적인 암 발생률은 최근 수십 년 동안 점진적으로 감소 하는 경향을 보이고 있지만, 지난 몇 십년 동안 피부 흑색 종 발생률은 두 성별 모두에서 지속적이 고 급속 한증가를 보여줍니다.
피부 흑색 종을 보다 효율적으로 퇴치 하기 위해, 임상적으로 효과적인 예방 방법을 더 잘 식별 하기 위해 원산지 세포에서 흑색 종 발달의 초기 사건을 명확 하 게 이해 하는 것이 중요 합니다. 현재 성체 줄기 세포는 피부 조직3,4,5등 다양 한 유형의 장기에서 암의 세포 기원으로 종양 형성에 크게 기여할 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 마찬가지로, 뮤 린 등 쪽 피부에 있는 성체 멜 라 닌 세포 (MCSCs)는 Ras/Raf 및 Akt 통로의 변종 활성화 시 기원의 흑색 종 세포로 서 일할 수 있다6. 그러나, 이러한 발암 돌연변이 단독은 정 맥 내에서 종양 형성을 효율적으로 유도할 수 없다. 멜 리 세포 종양은 결국 MCSCs 자연 헤어 사이클링 동안 활성화 될 때 개발. 그러나,이 프로토콜에서, 우리는 인위적으로 흑색 종 개시6의 정확한 통제를 촉진 하는 종양에 걸리기 쉬운 mcscs의 세포 활성화를 유도 하는 방법을 설명할 것입니다,7.
여기에 설명 된 방법을 통해 서, 피부 흑색 종의 공간적 및 시간적 제어는 종양 발생 가능성이 있는 MCSCs에서 시작 하 여 Pten 발현 손실과 함께 발암 성 brafV600E 을 발현 하 여 성공적으로 수행 될 수 있습니다. 이전에 보고 된6. 이 방법은 탈모를 통해 모 낭 줄기 세포 활성화를 보여주는 이전 연구 결과를 통합 하 고 뮤 린 피부를 UV-B에 노출 시키는 방법 뿐만 아니라 모 낭에 거주 하는 MCSCs의 활성화와이 세포의 이식에 도움이 될 수 있습니다. 간 모 낭 표 피6,9,10에 대 한 하위 집단. 이러한 생체 내 모델 시스템은 피부에 흑색 종의 현저한 개시를 유도할 수 있는 흑색 종 경향이 있는 MCSCs의 세포 상태를 변화 시킬 수 있는 생리 적 및 환경적 변화가 어떻게 하는지에 관한 귀중 한 정보를 제공할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
피부 흑색 종 종양에서 자주 발견 되는 홀 마크 유전 변경은 잘 설명 되어 있습니다13. 가장 지배적 인 드라이버 돌연변이는 BrafV600E이 고, brafV600E매개 흑색 종을 위한 유전적으로 조작 된 마우스 모델은 보 센 버그 그룹14 에 의해 생성 되 고 잭슨 실험실에서 증 착 되었다. 이 마우스 모델을 사용 하 여, 우리의 최근 연구는 등 쪽 피?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 W81XWH-16-1-0272에서 피어 검토 된 암 연구 프로그램을 통해 건강 문제에 대 한 국방부 장관 비서에 의해 지원 되었습니다. 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 것 이며 반드시 국방부가 승인 하지는 않습니다. 이 작업은 또한 A.C. 흰색에 코넬 줄기 세포 프로그램에서 종자 그랜트에 의해 지원 되었다. H. 달은 척추 동물 유전체학 학자 프로그램에 대 한 코넬 센터에 의해 지원 되었다.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Referenzen
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