Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.
Os esferoides tridimensionais de pilhas de cancro são ferramentas importantes para telas da droga do cancro e para ganhar a introspecção mecanicista na biologia da pilha de cancro. O poder desta preparação encontra-se em sua habilidade de imitar muitos aspectos das condições in vivo dos tumores ao ser rápido, barato, e versátil bastante permitir a seleção relativamente high-throughput. As condições da cultura esferóide podem recapitular os gradientes físico-químicos em um tumor, incluindo a crescente acidez extracelular, o aumento do lactato e a diminuição da disponibilidade de glicose e oxigênio, da periferia esferóide ao seu núcleo. Também, as propriedades mecânicas e as interações Cell-Cell de tumores in vivo são em parte imitada por este modelo. As propriedades específicas e, consequentemente, as condições ideais de crescimento, de esferóides 3D, diferem amplamente entre diferentes tipos de células cancerosas. Além disso, a avaliação da viabilidade celular e morte em esferóides 3D requer métodos que diferem em parte daqueles empregados para culturas 2D. Aqui nós descrevemos diversos protocolos para preparar esferoides 3D de pilhas de cancro, e para usar tais culturas para avaliar a viabilidade e a morte da pilha no contexto de avaliar a eficácia de drogas anticâncer.
O uso de modelos de esferóide multicelular na biologia do câncer é de várias décadas1,2, mas ganhou um impulso substancial nos últimos anos. Em grande parte, isso reflete o aumento da consciência de quão fortemente o fenótipo das células cancerosas é dependente do seu microambiente e condições de crescimento específicas. O microambiente em tumores sólidos é fundamentalmente diferente do que nos tecidos normais correspondentes. Isso inclui condições físico-químicas como pH, tensão de oxigênio, bem como pressão intersticial, gradientes de concentração de fatores solúveis, como nutrientes, resíduos e compostos de sinalização secretados (fatores de crescimento, citocinas). Além disso, inclui a organização da matriz extracelular (ECM), interações célula-célula e sinalização intercelular, e outros aspectos da arquitetura tridimensional (3D) particular do tumor3,4, 5,6. As condições microambientais específicas em que as células cancerosas existem, afetam profundamente seu perfil de expressão gênica e propriedades funcionais, e é claro que, em comparação com a das células cultivadas em 2D, o fenótipo de esferóides 3D muito mais estreitamente imita o dos tumores in vivo7,8,9,10,11. os modelos 2D, mesmo se empregam a hipóxia, o pH ácido, e as concentrações elevadas do lactato para imitar aspectos conhecidos do microambiente do tumor, ainda não conseguem capturar os gradientes de parâmetros physico-químicos que levantam-se dentro dos tumores, assim como seu tumor 3D Arquitetura. Por outro lado, os modelos animais são dispendiosos, lentos e eticamente problemáticos, e geralmente, também têm deficiências na sua capacidade de recapitular as condições do tumor humano. Consequentemente, os esferóides 3D têm sido aplicados como um modelo de complexidade intermediária em estudos de uma ampla gama de propriedades da maioria dos cânceres sólidos9,11,12,13, 14,15,16,17.
Um uso amplamente empregado de esferóides 3D está em ensaios de triagem da eficácia da terapia anticâncer9,18,19,20. As respostas ao tratamento são particularmente sensíveis ao microambiente tumoral, refletindo tanto o impacto da tortuosidade, a difusão restrita, a alta pressão intersticial, quanto o pH ambiental ácido na entrega de fármacos, e o impacto da hipóxia e outros aspectos do microambiente na resposta de morte celular9,17. Porque o ambiente dentro de esferoides 3D inerentemente desenvolve todas essas propriedades7,8,9,10,11, empregando culturas de células 3D pode melhorar substancialmente a tradução dos resultados para as condições in vivo, mas permitir uma triagem eficiente e acessível de alta taxa de transferência do crescimento líquido. No entanto, a grande maioria dos estudos sobre a resposta medicamentosa das células cancerosas ainda são realizadas em condições 2D. Isso provavelmente reflete que, enquanto alguns ensaios podem ser relativamente facilmente implementados para culturas de células 3D, muitos, como ensaios de viabilidade, western blotting, e análise de imunofluorescência, são muito mais convenientemente feito em 2D do que em 3D.
O objetivo do presente trabalho é fornecer ensaios facilmente amáveis e protocolos precisos para análises do efeito do tratamento com medicamentos anticancerígenos sobre a viabilidade de células cancerosas e sobrevivência em um tumor 3D que imita o ajuste. Especificamente, fornecemos e comparamos três métodos diferentes para a formação de esferóides, seguidos de métodos para análises qualitativas e quantitativas de crescimento, viabilidade e resposta a medicamentos.
O uso de esferoides da pilha do cancro 3D provou uma ferramenta valiosa e versátil não somente para a seleção anticâncer da droga, mas igualmente para ganhar a introspecção mecanicista na regulação da morte e da viabilidade da pilha de cancro as circunstâncias que imitam aquelas no tumor microambiente. Isto é particularmente crucial porque a acessibilidade, a captação celular, e os efeitos intracelular de drogas quimioterapêuticas são impactados profundamente pelas condições físico-químicas no tumor, i…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Katrine Franklin Mark e Annette Bartels pela excelente assistência técnica e pela Asbjørn Nøhr-Nielsen para realizar os experimentos na figura 1D. Este trabalho foi financiado pela Fundação Einar willumsen, pela Fundação Novo Nordisk e pela Fondation Juchum (tudo para SFP).
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |