في فيفو إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات العصبية الجديدة في دروسوفيلا melanogaster
Summary
نقدم بروتوكول باستخدام نهج وراثي إلى الأمام لفحص المتحولين الذين يظهرون التنكب العصبي في دروسوفيلا melanogaster. وهو يتضمن اختبار التسلق، وتحليل الأنسجة، ورسم خرائط الجينات وتسلسل الحمض النووي لتحديد الجينات الجديدة المتعلقة بعملية الحماية العصبية في نهاية المطاف.
Abstract
هناك الكثير لفهم حول ظهور وتطور الأمراض العصبية، بما في ذلك الجينات الكامنة المسؤولة. الفحص الجيني الأمامي باستخدام الطفرات الكيميائية هو استراتيجية مفيدة لرسم خرائط الأنماط الظاهرية المتحولة للجينات بين دروسوفيلا والكائنات الحية النموذجية الأخرى التي تشترك في المسارات الخلوية المحفوظة مع البشر. إذا لم يكن الجين المتحول الذي يهمه الأمر قاتلاً في المراحل التنموية المبكرة للذباب، يمكن إجراء فحص للتسلق للكشف عن المؤشرات الفينوتية لانخفاض أداء الدماغ، مثل انخفاض معدلات التسلق. في وقت لاحق، يمكن إجراء التحليل النسيجي الثانوي لأنسجة الدماغ من أجل التحقق من وظيفة محصنة للجين عن طريق تسجيل الأنماط الظاهرية للتكوين العصبي. وتشمل استراتيجيات رسم خرائط الجينات رسم الخرائط المتجانسة والقصور التي تعتمد على هذه الاختبارات نفسها يمكن أن يتبعها تسلسل الحمض النووي لتحديد التغيرات النيوكليوتيدات المحتملة في جين الفائدة.
Introduction
الخلايا العصبية هي في معظمها بعد mitotic وغير قادرة على تقسيم1،2. في معظم الحيوانات، توجد آليات محصنة للحفاظ على هذه الخلايا طوال عمر الكائن الحي، وخاصة في سن الشيخوخة عندما تكون الخلايا العصبية الأكثر عرضة للتلف. ويمكن تحديد الجينات الكامنة وراء هذه الآليات في المسوخ التي تظهر تنكس الأعصاب، وهو مؤشر فينوتيبيك لفقدان الحماية العصبية، وذلك باستخدام بروتوكول وراثي متقدم. الشاشات الوراثية الأمامية التي تستخدم الطفرات الكيميائية مثل إيثيل ميثانسولفونات (EMS) أو N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) مفيدة بشكل خاص بسبب الطفرات العشوائية التي تحفزها، مما يؤدي إلى نهج غير متحيز بطبيعته ألقى الضوء على العديد من الوظائف الجينية في الكائنات الحية نموذج eukaryotic3،4،5 (على النقيض من ذلك ، يخلق موت التناضح بالأشعة السينية فواصل الحمض النووي ويمكن أن يؤدي إلى إعادة ترتيب بدلا من الطفرات نقطة6).
ذبابة الفاكهة المشتركة Drosophila melanogaster هو موضوع مثالي لهذه الشاشات نظرا لجودته العالية، تسلسل الجينوم المشروح جيدا، تاريخها الطويل ككائن حي نموذجي مع أدوات وراثية متطورة للغاية، والأهم من ذلك، تقاسمها تاريخ تطوري مع البشر7,8. والعامل المحدد في انطباق هذا البروتوكول هو الفتك المبكر الناجم عن الجينات المتحولة، التيمن شأنها أن تمنع الاختبار في سن التاسعة من العمر . ومع ذلك، بالنسبة للطفرات غير المميتة، فإن اختبار التسلق، الذي يستفيد من التجواق الجغرافي ة السلبية، هو طريقة بسيطة، وإن كانت واسعة النطاق، لتحديد الأداء الحركي الضعيف10. لإظهار ما يكفي من التفاعل الحركي، يعتمد الذباب على الوظائف العصبية لتحديد الاتجاه، والشعور بموقفه، وتنسيق الحركة. عدم قدرة الذباب على الصعود بما فيه الكفاية استجابة للمحفزات يمكن أن تشير بالتالي إلى عيوب عصبية11. بمجرد تحديد النمط الظاهري التسلق المعيبة معينة، يمكن استخدام مزيد من الاختبارات باستخدام شاشة ثانوية مثل التحليل النسيجي لأنسجة الدماغ، لتحديد التنكّن العصبي في الذباب التسلق المعيبة. ويمكن بعد ذلك استخدام رسم خرائط الجينات اللاحقة للكشف عن المنطقة الجينية على الكروموسوم الذي يحمل الجين المعيب الذي يحمي الأعصاب. لتضييق المنطقة الكروموسومية ذات الأهمية، يمكن إجراء رسم الخرائط الميوتيكية باستخدام خطوط ذبابة متحولة تحمل جينات العلامات المهيمنة مع مواقع معروفة على الكروموسوم. تعمل جينات العلامة كنقطة مرجعية للطفرة حيث يوفر تردد إعادة التركيب بين موضعين مسافة قابلة للقياس يمكن استخدامها لرسم الموقع التقريبي للجين. وأخيرا، عبور خطوط متحولة مع خطوط تحمل أوجه القصور المتوازنة على منطقة الكروموسومات التي تم تعيينها بشكل مثيوتي يخلق اختبار تكملة التي يمكن التحقق من جين الفائدة إذا تم التعبير عن النمط الظاهري المعروف5. يمكن تقييم تسلسلات النيوكليوتيدات المتعددة الأشكال في الجين المحدد، مما قد يؤدي إلى تغيير تسلسل الأحماض الأمينية، من خلال تسلسل الجين ومقارنته بتسلسل جينوم دروسوفيلا. ويمكن أن يشمل التوصيف اللاحق لجين الاهتمام اختبار الأليلات اتوّه اتّصال اتّصال إضافيّة، وتجارب إنقاذ الطفرة، وفحص الأنماط الظاهرية الإضافية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكانت الشاشات الوراثية الأمامية في دروسوفيلا نهجا فعالا لتحديد الجينات المشاركة في العمليات البيولوجية المختلفة، بما في ذلك الحماية العصبية المعتمدة على العمر5،23،24، 25.باستخدام هذه الاستراتيجية، كنا ناجحين في ت?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون بشكل خاص للدكتور باري غانتزكي، في مختبر الذي تم إجراء الشاشة الوراثية، مما يسمح بتحديد وتوصيف brat كجين محصن. نشكر الدكتور ستيفن روبينو على التكرم بتوفير مجموعة من الذباب ENU-mutagenized المستخدمة في الشاشة الوراثية المعروضة في هذه المقالة. نشكر أعضاء مختبر غانيتزكي، والدكتورغريس بوخوف فالك وديفيد واسارمان على المناقشات المفيدة طوال مدة هذا المشروع، لينغ لينغ هو وبوب كريبر على المساعدة التقنية، والدكتور آكي إيكيدا على استخدام مرفقه الصغير في جامعة ويسكونسن والدكتور كيم لاكي ومرفق التحليل البصري في جامعة ألاباما.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
Referenzen
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. Genetik. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. Genetik. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. Genetik. 161 (3), 1197-1208 (2002).
