Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Summary

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Abstract

Organelas celulares, como mitocôndrias e retículo endoplasmático (er), criam uma rede para realizar uma variedade de funções. Estas estruturas altamente curvas são dobradas em várias formas para formar uma rede dinâmica, dependendo das condições celulares. A visualização desta rede entre mitocôndria e ER foi tentada usando a imagem latente e a microscopia de luz super-resolution da fluorescência; no entanto, a resolução limitada é insuficiente para observar as membranas entre as mitocôndrias e ER em detalhes. A microscopia eletrônica de transmissão proporciona um bom contraste de membrana e uma resolução de escala nanométrica para a observação de organelas celulares; no entanto, é excepcionalmente demorado ao avaliar a estrutura tridimensional (3D) de organelas altamente curvadas. Conseqüentemente, nós observamos a morfologia das mitocôndrias e do ER através da microscopia correlativa da luz-elétron (CLEM) e das técnicas da microscopia de elétron do volume usando a peroxidase realçada 2 do ascorbato e a mancha da peroxidase do rábano. Um método de coloração em bloco, o corte de série ultrafinos (tomografia de matriz) e a microscopia eletrônica de volume foram aplicados para observar a estrutura 3D. Neste protocolo, nós sugerimos uma combinação de CLEM e de microscopia de elétron 3D para executar estudos estruturais detalhados das mitocôndria e do ER.

Introduction

As mitocôndria e o retículo endoplasmático (er) são organelles celulares membrana-limitados. Sua conexão é necessária para sua função, e as proteínas relacionadas à sua rede foram descritas¹. A distância entre a mitocôndria e o ER foi relatada como aproximadamente 100 nanômetro usando a microscopia de luz²; Entretanto, a microscopia recente da super-definição³ e a microscopia de elétron (em)⁴ estudos revelaram-na consideravelmente menor, em aproximadamente 10-25 nanômetro. A resolução obtida na microscopia de superresolução é menor que EM, e é necessária a rotulagem específica. EM é uma técnica apropriada para alcançar um contraste suficientemente de alta resolução para estudos estruturais das conexões entre mitocôndria e ER. Entretanto, uma desvantagem é a informação limitada do eixo z porque as seções finas devem ser aproximadamente 60 nanômetro ou mais finas para a microscopia de elétron convencional da transmissão (TEM). Para uma imagem EM z-axis suficiente, a microscopia eletrônica tridimensional (3DEM) pode ser usada⁵. No entanto, isso envolve a preparação de centenas de seções seriais finas de células inteiras, o que é um trabalho muito complicado que apenas alguns tecnólogos qualificados têm dominado. Estas seções finas são coletadas em grades de um furo de um buraco com revestimento de película de formvar frágil. Se a película quebra em um Gird, a imagem latente de série e a reconstrução do volume não são possíveis. A microscopia eletrônica de varredura do bloco-cara de série (SBEM) é uma técnica popular para 3DEM que use o corte destrutivo do bloco do en dentro da câmara de vácuo do microscópio de elétron da varredura (SEM) com uma faca do diamante (Dik-SBEM) ou um feixe focalizado do íon (FIB-SEM) ⁶. no entanto, porque essas técnicas não estão disponíveis em todas as instalações, sugerimos tomografia de matriz⁷ usando corte Serial e sem. No tomography da disposição, as seções de série cortadas usando um ultramicrotome são transferidas a um lamela de vidro em vez de uma grade de tem e visualizadas através da microscopia de luz e do sem⁸. Para aumentar o sinal para a imagem latente do elétron do backscatter (BSE), nós utilizamos um en Bloc em que mancha o protocolo que emprega o tetróxido do ósmio (Oso₄)-pilhas fixas com thiocarbohydrazide osmiophilic (tch)⁹, permitindo que nós obtenhamos imagens sem coloração dupla pós-incorporação.

Adicionalmente, o marcador mitocondrial SCO1 (citocromo c oxidase assembly protein 1) – ascorbato peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ molecular tag foi usado para visualizar mitocôndria no nível de em. APEX2 é de aproximadamente 28 kDa e é derivado de ascorbato de soja peroxidase¹¹. Foi desenvolvida para mostrar a posição detalhada de proteínas específicas no nível do em da mesma maneira que a proteína proteína-etiquetada fluorescente verde é usada na microscopia de luz. APEX2 converte 3, 3 ‘-diaminobenzidina (DAB) em um polímero osmiofílico insolúvel no local da tag na presença do peróxido de hidrogênio cofator (H₂o₂). APEX2 pode ser usado como uma alternativa à rotulagem tradicional do anticorpo no em, com uma localização da proteína durante todo a profundidade da pilha inteira. Em outras palavras, a proteína APEX2-etiquetada pode ser visualizada pelo osmication específico¹¹ sem rotulagem immunogold e permeabilização após ultra-cryosectioning. A peroxidase de rábano (HRP) também é uma marca sensível que catalisa a polimerização de H₂o₂dependente de DAB em um precipitado localizado, proporcionando contraste em em após o tratamento com Oso₄. A sequência do peptídeo alvo de ER HRP-KDEL (Lys-Asp-Glu-leu)¹² foi aplicada para visualizar er dentro de uma célula inteira. Para avaliar nosso protocolo de utilização de Tags genéticas e de coloração em bloco com ósmio reduzido e TCH (método rOTO), utilizando o efeito de osmicação ao mesmo tempo, comparamos o contraste da membrana com e sem o uso de cada tag genético na mancha de rOTO en Bloc. Embora 3DEM com tomografia de matriz e coloração DAB com APEX e HRP tenham, respectivamente, sido utilizados para outros fins, nosso protocolo é único porque temos combinado tomografia de matriz para 3DEM e DAB coloração para mitocôndria e ER rotulagem. Especificamente, nós mostramos cinco pilhas com e sem os genes APEX-etiquetados na mesma seção, que ajudada em investigar o efeito da modificação genética em pilhas.

Protocol

1. cultura de pilha com o transfection modelado do prato e da pilha da cultura da grade com SCO1-APEX2 e vetor do plasmídeo de HRP-KDEL Semente 1 x 105 HEK293T células, colocando-os em 35-mm de vidro grade-fundo pratos de cultura em uma atmosfera humidificada contendo 5% co2 a 37 ° c em Dulbecco ‘ s modificado Eagle ‘ s médio (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino, 100 U/ml penicilina e 100 U/mL de estreptomicina. O dia após a semeadura das células, quando eles cresc…

Representative Results

A Figura 1 descreve a agenda e o fluxo de trabalho para este protocolo. O protocolo requer 7 dias; no entanto, dependendo do tempo gasto na imagem SEM, isso pode aumentar. Para o transfection da pilha, a confluência das pilhas deve ser controlada de modo a para não cobrir a parte inferior da placa de grade inteira (Figura 1a). Uma densidade elevada da pilha poderia impedir a identificação da pilha do interesse durante o microscópio claro e a observação de EM. Nós usamos plasmíde…

Discussion

Determinar a localização celular de proteínas específicas em uma resolução de nanômetro usando EM é crucial para compreender as funções celulares das proteínas. Geralmente, existem duas técnicas para estudar a localização de uma proteína alvo via EM. Uma delas é a técnica imunogantiga, que tem sido usada em em desde 1960, e a outra é uma técnica utilizando Tags geneticamente codificadas recentemente desenvolvidas¹⁶. As técnicas immunogold tradicionais empregaram partículas de …

Materials

Glutaraldehyde	EMS	16200	Use only in fume hood
Paraformaldehyde	EMS	19210	Use only in fume hood
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution	EMS	16320	Use only in fume hood
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
35mm Gridded coverslip dish	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger	Pelco	easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid	Ted Pella	01805-F
Hydrochloric acid	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)	SIGMA	D8001	Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution	Merck	107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	SIGMA	P3289
0.22 um syringe filter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazide	SIGMA	223220	Use only in fume hood
Potassium hydroxide	Fluka	10193426
L-aspartic acid	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips	SPI	06489-AB	fragil glass
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamond knife	Leica	AT-4
Inveted light microscopy	Nikon	ECLipse TS100
Scanning electron microscopy	Zeiss	Auriga