BK-polyomavirus kodlama dışı kontrol bölgesini Akış sitometrisi yoluyla transkripsiyon aktivitesinin ölçümü
Summary
Bu yazıda, tdTomato ve eGFP ‘i ifade eden bir çift yönlü muhabir Plasmid ile nakledilmiş HEK293T hücrelerini kullanarak BK-polyomavirus transkripsiyon aktivitesinin FACS tabanlı ölçümünü gerçekleştirmek için bir protokol sunulmuştur. Bu yöntem daha da Nicek viral transkripsiyon üzerinde yeni bileşiklerin etkisini belirlemek için izin verir.
Abstract
BK-polyomavirus (BKPyV) gibi polyomaviruses, bağışıklık sistemini tehlikeye atılan hastalarda şiddetli patolojilere neden olabilir. Ancak, son derece etkili antiviral Şu anda mevcut olmadığı için, potansiyel anti-virüs ajanların etkisini ölçme yöntemleri gereklidir. Burada, BKPyV kodlama olmayan kontrol bölgesinin (NCCR) erken ve geç organizatörü aktivitesinin analizine izin veren bir çift floresan muhabiri, potansiyel antiviral ilaçların tdTomato ve eGFP aracılığıyla viral gen ifadesinde etkisini ölçmek için inşa edildi Ifa -de. Buna ek olarak, bu protokolde, immünolojili renal nakledilen hastaların kan türeği DNA ‘sından örnek olarak elde edilen bkpyv-nccr amplikonlar klonlayarak, nccr-redüzenlemeleri viral gen ifadesi üzerine etkisi tespit edilebilir. Hasta türevi amplicons klonlama sonrasında, HEK293T hücreler muhabiri-plazmids ile transferleştirilmiş ve potansiyel antiviral ajanlar ile tedavi edildi. Daha sonra hücreler, ortalama floresans yoğunlukları 72 h Post transfeksiyon ölçümü için FACS-analizine tabi tutulmuştur. Ayrıca potansiyel bir hücre döngüsü inhibe etkisi olan ilaçların analizini test etmek için, sadece transfekte ve böylece floresan hücreler kullanılır. Bu tahlil büyük T antijeni hücre ifade gerçekleştirildiği için, erken ve geç ifade etkisi karşılıklı bağımsız bir şekilde analiz edilebilir.
Introduction
Polyomaviruses küçük çift telli DNA bağımsız bir aile temsil (dsDNA) Simian virüsü 40 ile virüsler (BAZıLARıNDA SV40) bir prototip türü olarak. Primer enfeksiyon çoğunlukla çocukluk çağında oluşur, genellikle hastalık belirtileri olmadan devam ve genellikle bağışıklık yetkili konaklarında gizli enfeksiyonlara neden. BK-polyomavirus (BKPyV), renal tübüller hücrelerinde nefropatolojilere neden olmadan çoğunlukla devam eder, ancak böbrek nakli sonrasında bağışıklık-yetkinliğin bozulması durumunda virüs yeniden etkinleştirebilir ve şiddetli zararlar verebilir ve greft bozulması yüksek viremi ulaştığında fonksiyon (1 x 104 bkpyv DNA kopyaları/ml)1,2. Böbrek nakli alıcılarının yaklaşık% 10 ‘ unda, BK-polyomavirüsdür (bkpyv) ‘ ın yeniden aktivasyonu, renal allogreft arızaları yüksek riskiyle ilişkili% 80 ‘ a kadar olan polyomavirüsdür Associated nefropati (pyvan) ile sonuçlanır3,4 . Hiçbir onaylı antiviral ajanlar mevcut olduğundan, mevcut tedavi immünerbastırma azaltılması dayanmaktadır. İlginçtir, mTOR inhibitörleri bir antiviral etkiye sahip gibi görünüyor; Bu nedenle, immünpresif tedavisini mTOR bazlı immünerimoterapi ile değiştirmek, bkpyv viremi5,6,7‘ nin ilerlemesini önlemek için alternatif bir yaklaşım gösterebilir. Ancak, mTOR tabanlı antiviral mekanizması şu anda hala tamamen anlaşılır. Böylece potansiyel antiviral ajanların klinik olarak ilgili konsantrasyonlarda etkisini ölçen Yöntemler gereklidir.
BKPyV ‘in dairesel genomu, çoğaltmanın kökeni olarak hizmet veren ve erken ve geç faz mRNA transkriptinin ifadesini kullanan çift yönlü bir promotör olan bir kodlama olmayan kontrol bölgesini (NCCR) barındıran yaklaşık 5 KB ‘den oluşur. Nccr-redüzenlemeler, silmeler ve çoğaltmalar ortaya çıktığı için patojenik bkpyv8 ‘ de bulunan ve pvan5,9, arketipsel (WT) bir karşılaştırma muzdarip hastalarda önemli ölçüde birikmiş yeniden düzenlenmiş (RR) NCCR-faaliyetler viral çoğaltıcı Fitness karakterize etmek yararlıdır.
Şekil 1‘ de özetlendiği gibi, bu protokol, bir muhabirin Plasmid5‘ den ifade edilen iki fluorophores tdtomato ve EGFP floresans ölçerek bkpyv nccr transkripsiyonel etkinliğini ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemi açıklar, 9,10,11. Prosedür, potansiyel antiviral ajanların erken ve geç NCCR-aktivite ayrı5üzerinde etkisini analiz etmek için ızın veren bazılarında SV40 büyük T antijeni (LTag), varlığında gerçekleştirilir. Bu tahlil daha nccr aktivite ve WT-nccrs ile karşılaştırma üzerinde yeniden düzenlemeleri etkisini analiz5,9. Muhabir plazmid, her bir fluorophore açık okuma çerçevesinin bazılarında SV40 geç Poliadenilasyon sinyallerini, sırasıyla tdtomato ve EGFP için her iki transkriptin karşılaştırılabilir ve verimli bir şekilde işlenmesini sağlamak için harborlar. QRT-PCR tabanlı yöntemler5,12ile karşılaştırıldığında, bu FACS tabanlı yaklaşım, virüslü hücre kültürü için karmaşık ayıklama protokolleri olmadığından ve pahalı olmayan bir düşük maliyetli ve yüksek verimlilik uyumlu alternatifi temsil eder bağışıklık floresan boyama için antikorlar gereklidir. Ayrıca, tanımlanan bir miktar floresan hücre Akış sitometrisi aracılığıyla analiz edildiğimden, hücre döngüsü inhibe edici ajanların analizi de nicel bir şekilde mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, sık kullanılan bir yöntem, bkpyv kodlama olmayan denetim bölgesi (nccr) erken ve geç Organizatör etkinliği yönetilen analizi için olanak sağlar sunulmuştur. Nccr aktivite aynı anda ölçülebilir ve transfekte hücrelerin lizis gerekmez. Dahası, nispeten çok sayıda hücre analiz edilebilir ve floresan değerlerinin normalleştirilmesi için ek işaretçilerin eş transfeksiyonunu gerekli değildir.
Bu yöntemin kritik bir kısmı, klonlanmış nccr ‘nin, hasta plazm…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar mükemmel teknik yardım için Barbara Bleekmann teşekkür ederiz. Bu çalışmalar, Duisburg-Essen Tıp Fakültesi ‘nin IFORES-programı ve Üniversitesi Ittifak Ruhr ve Mercator araştırma merkezi Ruhr (MERCUR) RIMUR-programı tarafından destekleniyor. Yazarlar, Helene Sertznig ‘in Doktora Bursu ve sürekli destek için Jürgen-Manchot-Stiftung ‘ a teşekkür ederler. Hasta materyalinin toplanması ve kullanımı, Duisburg-Essen (14-6028-BO) Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
Referenzen
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
