Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden
Summary
In dit artikel presenteerden we een reeks praktische en haalbare methoden voor het karakteriseren van ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en complementaire Split plaats assay.
Abstract
De snel versnelde fibrosarcoma (RAF) familie kinasen spelen een centrale rol in de celbiologie en hun disfunctie leidt tot kankers en ontwikkelingsstoornissen. Een karakterisering van ziekte-gerelateerde RAF mutanten zal ons helpen bij het selecteren van passende therapeutische strategieën voor de behandeling van deze ziekten. Recente studies hebben uitgewezen dat de kinasen van de RAF-familie zowel katalytische als allosterische activiteiten hebben, die strak gereguleerd worden door dimerisatie. Hier bouwden we een reeks praktische en haalbare methoden om de katalytische en allosterische activiteiten en de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van RAF familie kinasen en hun mutanten te bepalen. Ten eerste hebben we de klassieke in-vitro kinase assay aangepast door de detergens concentratie in buffers te verminderen, gebruikmakend van een zachte Quick Wash procedure, en het gebruik van een glutathion S-transferase (GST) fusie om te voorkomen dat RAF Dimeren van dissociatie tijdens Zuivering. Dit stelt ons in staat om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten adequaat te meten. Ten tweede ontwikkelden we een roman RAF co-Activation assay om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten te evalueren door gebruik te maken van N-terminale afgeknotte RAF-eiwitten, waardoor de eis van actieve RAS in huidige protocollen wordt geëlimineerd en daardoor een hogere Gevoeligheid. Ten slotte genereerden we een unieke complementaire Split plaats-test om de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van verschillende RAF-mutanten te kwantificeren, wat betrouwbaarder en gevoeliger is in vergelijking met de traditionele Co-Immunoprecipitation-assay. Kortom, deze methoden hebben de volgende voordelen: (1) gebruiksvriendelijk; (2) in staat zijn om effectief te kunnen uitvoeren zonder geavanceerde apparatuur; (3) kosteneffectief; (4) zeer gevoelig en reproduceerbaar.
Introduction
De RAF familie kinases zijn een belangrijk onderdeel van RAS/RAF/MEK/ERK signalering Cascade, die een signaal van RAS te activeren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MEK)1,2,3,4. Deze familie van kinasen speelt een cruciale rol in celgroei, overleving en differentiatie, en hun veranderingen induceren vele ziekten, met name kanker5,6,7,8. Onlangs hebben genomische sequencings veel ziektegerelateerde RAF-mutanten geïdentificeerd die verschillende eigenschappen vertonen in de signaaloverdracht van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade9,10,11. Een zorgvuldige karakterisering van de mutanten van de RAF zal ons helpen de moleculaire mechanismen te begrijpen van hoe de mutanten van de RAF de signaal output van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade veranderen, en uiteindelijk passende benaderingen selecteren voor de behandeling van verschillende door de RAF gemuteerde ziekten.
De familie van de RAF kinases omvatten drie leden, CRAF, braf, en Araf, die vergelijkbare moleculaire structuren, maar verschillende capaciteiten te activeren downstream signalering1,2,3,4. Onder deze paralogs heeft braf de hoogste activiteit op grond van zijn constitutief gefosforyleerde NTA (N–terminal acidic) motief12,13,14, terwijl Araf de laagste activiteit die voortvloeit uit het niet-canonieke APE motief15. Dit kan verklaren de verschillende mutatie frequenties van RAF paralogs in ziekten: BRAF > CRAF > ARAF. Bovendien, binnen dezelfde RAF Paralog, mutaties in verschillende locaties kunnen leiden tot downstream signalering in verschillende manieren, die voegt een extra laag van complexiteit aan de regulering van de RAF familie kinases. Recente studies hebben aangetoond dat alle RAF kinases zowel de katalytische als de allosterische activiteiten13,14,16,17,18hebben. Constitutief actieve RAF-mutanten zetten de stroomafwaartse signalering rechtstreeks door fosforylating MEK, terwijl kinase-dode RAF-mutanten hun wild type tegenhangers kunnen transactiveren door middel van Side-to-side door dimerisatie en MEK-ERK-signalering16 activeren ,19,20. De dimeer-affiniteit/-stabiliteit is een belangrijke parameter die niet alleen de allosterische activiteit van kinase-dode RAF-mutanten bepaalt, maar ook de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten beïnvloedt,15,21, 22. de kinase-dode RAF mutanten met een hoge dimeer affiniteit/stabiliteit kunnen de endogene wild-type RAFs rechtstreeks transactiveren15, terwijl die met intermediaire dimeer affiniteit/stabiliteit vereist een coördinatie van actieve RAS of een verhoogde niveau van wild-type RAF moleculen om te functioneren13,15,20,21,23. Evenzo, grondwettelijk actieve RAF mutanten fosforylaat MEK in een dimeer-afhankelijke manier, en degenen met een lage dimeer affiniteit/stabiliteit verliezen hun katalytische activiteit in vitro op immunoprecipitatie die de zwakke RAF Dimeren breekt15, 21,22. De dimeer affiniteit/stabiliteit bepaalt ook de gevoeligheid van de RAF mutanten aan hun remmers, en positief correleert met de weerstand van de RAF-remmers24. Om ziekte-gerelateerde RAF-mutanten te karakteriseren, is het daarom noodzakelijk om hun katalytische en allosterische activiteiten te meten, en dimeer affiniteit/stabiliteit.
In de afgelopen jaren hebben ons laboratorium en anderen verschillende methoden ontwikkeld om RAF familie kinasen en hun mutanten te karakteriseren. Volgens ons laboratorium en de ervaring van anderen, denken we dat de volgende drie assays voordelen hebben bij het bepalen van ziekte-gerelateerde RAF-mutanten: (1) de in vitro kinase assay die gemakkelijk kan worden uitgevoerd om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF mutanten15; (2) de RAF co-Activation assay is een betrouwbare en handige methode om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten13,15,21,22,23, 25; (3) de gratis gesplitste plaats test die een veel hogere gevoeligheid heeft bij het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de mutanten van de RAF in tegenstelling tot de traditionele Co-Immunoprecipitation Assay, en is in staat om uit te voeren zonder geavanceerde apparatuur in contrast met de kwantitatieve analytische methoden zoals SPR (Sppervlakte Plasmon Resonance) analyse15,22. Door deze drie testen te combineren, kunnen we gemakkelijk begrijpen hoe een ziektegerelateerde RAF Mutant de downstream signalering verandert en zo een geschikte therapeutische strategie gebruiken om de ziekte te behandelen die wordt veroorzaakt door deze RAF-mutatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteerden we drie methoden voor het karakteriseren van de ziekte-gerelateerde RAF mutanten, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en gratis Split plaats assay. Aangezien RAF kinases zowel katalytische activiteit als allosterische activiteit hebben, kunnen verschillende RAF-mutanten de stroomafwaartse signalering activeren via twee verschillende mechanismen13,14,16,<sup class="xre…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de Hairy Cell Leukemia Fellowship voor steun van Yuan Jimin erkennen. Dit werk werd gesteund door Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), hertog-NUS Khoo Bridge funding Award (hertog-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging subsidie (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), en SHF academische geneeskunde Onderzoeksbeurs (AM/TP011/2018).
Materials
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
Referenzen
- Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
- Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
- Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 “kinase”. FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
- Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
- Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
- Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
- McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
- Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
- Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
- Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
- Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
- Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
- Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
- Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
- Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
- Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
- Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
- Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
- Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
- Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
- Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
- Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
- Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
- Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
- Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
- Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Krebsforschung. 61 (9), 3595-3598 (2001).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
- Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).
- Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. “RAF” neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
- García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
- Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
- Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
- Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).
