Анализ Spliceosomal snRNA Локализация в клетках гели человека с использованием микроинъекции
Summary
Биогенез spliceosomal snRNAs является сложным процессом с участием различных клеточных отсеков. Здесь мы использовали микроинъекцию флуоресцентно маркированных snRNAs для того, чтобы контролировать их транспортировку внутри клетки.
Abstract
Биогенез spliceosomal snRNAs представляет собой сложный процесс, включающий как ядерные, так и цитоплазмические фазы, и последний шаг происходит в ядерном отсеке под названием тело Каджала. Однако последовательности, которые направляют локализацию snRNA в эту субнуклеарную структуру, не были известны до недавнего времени. Для определения последовательностей, важных для накопления snRNA в телах Cajal, мы использовали микроинъекции флуоресцентно помечены snRNAs следуют их локализации внутри клеток. Во-первых, мы подготовили snRNA удаления мутантов, синтезированные шаблоны ДНК для транскрипции в пробирке и транскрибированные snRNAs в присутствии UTP в сочетании с Alexa488. Маркированные snRNAs были смешаны с 70 kDa-Dextran спрягались с TRITC, и микровводили к ядру или цитоплазме клеток человека HeLa. Клетки были инкубированы в течение 1 ч и фиксированной и cajal маркер каулин был визуализирован косвенным иммунофлуоресценции, в то время как snRNAs и dextran, который служит маркером ядерной или цитоплазматической инъекции, наблюдались непосредственно с помощью флуоресценционного микроскопа. Этот метод позволяет эффективно и быстро проверить, как различные последовательности влияют на локализацию РНК внутри клеток. Здесь мы показываем важность Последовательности Sm-связывания для эффективной локализации snRNAs в тело Cajal.
Introduction
РНК сращивания является одним из важнейших шагов в экспрессии генов, который катализируются большой рибонуклеопротеин комплекс называется spliceosome. В общей сложности, более 150 белков и 5 небольших ядерных РНК (SnRNAs) интегрированы в spliceosome на различных стадиях сплайсинга пути. U1, U2, U4, U5 и U6 snRNA участвуют в сращивании крупных интронов GU-AG. Эти snRNAs присоединиться к spliceosome как предварительно сформированные небольшие частицы ядерного рибонуклеопротеина (snRNPs), которые содержат snRNA, семь Sm белков, связанных с snRNA (или Like-Sm белков, которые ассоциируются с U6 snRNA) и 1-12 белков, специфичных для каждого snRNP.
Сборка snRNPs включает цитоплазмамические и ядерные этапы. Недавно транскрибируемая snRNA экспортируется в цитоплазму, где она приобретает кольцо, собранное из семи белков Sm. Кольцо Sm впоследствии служит сигналом для повторного импорта snRNA обратно в ядро. Дефектные snRNAs, которые не связаны с белками Sm сохраняются в цитоплазме1. Недавно импортированные snRNPs впервые появляются в организме Cajal, где они отвечают snRNP-специфических белков и закончить их созревания (рассмотрено в ссылке2,3). Недавно мы показали, что ингибирование окончательных шагов созревания приводит к секвестрации незрелых snRNPs в телах Cajal4,5. Мы предложили модель, в которой окончательное созревание snRNP находится под контролем качества, который отслеживает добавление белков, специфических snRNP, и формирование активных snRNPs. Однако молекулярные детали того, как клетки различают правильно собранные зрелые и аномальные незрелые частицы, остаются неуловимыми.
Для определения последовательностей snRNA, которые необходимы для ориентации и накопления snRNAs в ядерных телах Cajal, мы решили использовать микроинъекцию флуоресцентно маркированных snRNAs. Микроинъекция была методом выбора, потому что: 1) она не требует дополнительной последовательности тега, чтобы различать синтетические snRNAs форме их эндогенных аналогов, что особенно важно для коротких РНК с небольшим пространством для включения дополнительных последовательность тегов; 2) он позволяет анализе последовательностей, которые важны для биогенеза. Например, последовательность Sm имеет важное значение для сборки кольца Sm и реимпорта в ядро6. Когда snRNAs выражены в клетке, snRNAs не хватает Sm последовательность деградируют в цитоплазме и не достигают ядра и Cajal органов7. Тем не менее, snRNAs без последовательности Sm может быть непосредственно микровисван в ядро и, таким образом, потенциальную роль последовательности Sm в локализации тела Cajal анализ.
Здесь мы подробно описываем метод микроинъекций, который мы применили для определения последовательностей snRNA, необходимых для целевой snRNAs в тело Cajal5. Мы показали, что Sm и SMN связывания сайты вместе необходимы и достаточны для локализации не только snRNAs, но различные короткие некодирования РНК в тело Cajal. Основываясь на микроинъекциях, а также других доказательствах, мы предположили, что кольцо Sm, собранное на месте связывания Sm, является сигналом локализации тела Cajal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы использовали микроинъекцию флуоресцентно маркированных snRNAs для определения последовательностей, важных для локализации snRNA в ядерные тела Cajal. Благодаря быстрой и довольно простой подготовке маркированных РНК (подготовка шаблона ДНК ПЦР с последующим транскрипцией in vitro) метод пре…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Чешским научным фондом (18-10035S), Национальной программой устойчивого развития I (LO1419), институциональной поддержкой (RVO68378050), Европейским фондом регионального развития (К.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775) и Грантовое агентство Карлов университет (GAUK 134516). Мы также признаем, свет микроскопии Core фонда, IMG CAS, Прага, Чешская Республика (при поддержке грантов (Чешская-Биоизображение – LM2015062).
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
Referenzen
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs – friends with benefits. RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).
- Stanek, D., Fox, A. H. Nuclear bodies: news insights into structure and function. Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).
- Novotny, I., et al. SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies. Cell Reports. 10, 429-440 (2015).
- Roithova, A., et al. The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation. Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).
- Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).
- Shukla, S., Parker, R. Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion. Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).
- Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling. Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
