Dieser Artikel beschreibt einen einfachen PCR-basierten Assay, um die Aktivität eines aktiven LINE-1-Retrotransposons zu überwachen und de novo Retrotranspositionen in einem bestimmten Genom abzubilden. Anhand der MCF7-Zelllinie zeigen wir hierin, wie diese Methode angewendet werden kann, um die Aktivität einer LINE-1 zu erkennen, die sich bei 22q12.1 befindet.
Lange durchsetzte Kernelemente 1 (LINE-1s) sind die einzige Familie mobiler genetischer Elemente im menschlichen Genom, die sich autonom bewegen können. Sie tun dies durch einen Prozess namens Retrotransposition, bei dem sie zu einem mRNA-Zwischenprodukt transkribieren, das dann durch umgekehrte Transkription in das Genom eingeführt wird. Obwohl LINE-1in normalen Zellen still ist, sind sie bei verschiedenen Epitheltumoren sehr aktiv. De novo LINE-1-Einfügungen können potenziell die Tumorgenese antreiben, und daher ist es wichtig, die LINE-1-Retrotranstion bei Krebs systematisch zu untersuchen. Von den 150 retrotranspositionskompetenten LINE-1, die im menschlichen Genom vorhanden sind, ist nur eine Handvoll LINE-1-Loci, auch als “heiße” LINE-1s bezeichnet, für den Großteil der de novo LINE-1-Einfügung in verschiedene Krebsarten verantwortlich. Wir haben eine einfache, auf Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende Methode entwickelt, um die Retrotranspositionsaktivität dieser heißen LINE-1zuüberwachen. Diese Methode, basierend auf der Invers-PCR (LDI)-PCR, nutzt die 3-“Transduktion”, einen Mechanismus, mit dem eine LINE-1 ihren flankierenden, nicht repetitiven Bereich mobilisiert, der anschließend zur Identifizierung von de novo LINE-1 3-Transduktionsereignissen verwendet werden kann. aus einer bestimmten heißen LINE-1.
Long interspersed nuclear elements (LINE-1s) sind eine Familie mobiler genetischer Elemente, die Retrotransposons genannt werden und sich unabhängig von einem Ort zum anderen bewegen können, über einen Kopier- und Pastenmechanismus namens Retrotransposition. Im Laufe der Evolutionszeit hat das menschliche Genom mehr als 500.000 Kopien von LINE-1-Wiederholungen1angesammelt. Die meisten der im Genom vorhandenen LINE-1-Kopien sind jedoch mutiert und können sich daher nicht über retrotransposition bewegen; nur 150 Kopien haben intakte Kopie der DNA-Sequenz notwendig, damit sie2bewegen. In normalen somatischen Zellen wird die Beweglichkeit dieser LINE-1 durch verschiedene Wirtsfaktoren eingeschränkt3. Diese Einschränkungen werden bei verschiedenen Epitheltumoren gelindert, was dazu führt, dass LINE-1sausgegrenzt werden und viele De-Novo-Einfügungen in das Tumorgenom 4 führen. Einige dieser tumorassoziiertenDe-Novo-Einfügungen haben gezeigt, dass insertionale Mutagenese in Dengenen verursacht wird, was die Tumorprogression 5,6antreibt. Daher ist es wichtig, neuartige Einfügungen im Tumorgenom abbilden zu können.
Vorhandene Methoden zum Erkennen von de novo LINE-1-Einfügungen verwenden (1) Ganzgenom-Sequenzierungsansatz4,7,8, wo verschiedene Rechenalgorithmen verwendet werden, um de novo LINE-1-Einfügungen zu finden aus WGS-Daten oder (2) Sequenzierung der nächsten Generation, die auf das 3-Ende der jungen, potenziell aktiven LINE-1s9,10,11,12,13abzielt. Die Suche nach neuartigen Einfügungen unter mehreren tausend nahezu identischen Kopien mit diesen Methoden ist jedoch alles andere als trivial, und die Herausforderung wird durch Tumorheterogenität und genomische Veränderungen im Zusammenhang mit LINE-1-Einfügung4noch verschärft.
Studien mit diesen bestehenden Methoden zeigten, dass nur wenige LINE-1s die Mehrheit der de novo LINE-1-Einfügungen ausmachen, die bei Tumoren 7,8beobachtet wurden. Um zu beantworten, ob eine bestimmte Tumorprobe die LINE-1-Aktivität anzeigt, genügt es daher, Retrotranspositionsereignisse zu kartieren, die durch diese Handvoll hochaktiver LINE-1-Loci verursacht werden. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methode14, die verwendet werden kann, um die Aktivität eines bestimmten LINE-1-Lokus im ersten Intron des TTC28-Gens bei 22q12.1 zu überwachen, das bei Dickdarm- und Enddarmkrebs hochaktiv ist. 7 , 8. Dieser LINE-1-Ort wird im gesamten Artikel als TTC28-LINE-1 bezeichnet. Dieser Test identifiziert speziell de novo LINE-1 Retrotranspositionsereignisse, die nicht repetitive Sequenzen auf dem 3-A-Flankenbereich der Quelle LINE-1 durch einen Mechanismus namens 3 ‘transduction15‘ mobilisieren. 3 – Transduktion erfolgt aufgrund des schwachen LINE-1-Polyadenylierungssignals (PAS), das bewirkt, dass die Transkriptionsmaschinerie sie überspringt und stattdessen die Transkription am stärkeren PAS nachgeschaltet beendet, wodurch die flankierende nicht repetitive Sequenz erfasst wird ( von nun an als “einzigartiges Tag” bezeichnet), das dann neben der LINE-1-Sequenz in die Zielposition eingefügt wird. Philippe et al.16 haben kürzlich gezeigt, dass verschiedene Zelltypen unterschiedliche LINE-1-Loci ausdrücken können. Angesichts dieser Feststellung kann diese Methode angewendet werden, um die Aktivität der am stärksten ausgedrückten LINE-1 zu überwachen, die ihr einzigartiges Tag in der Krebsart des Interesses mobilisieren.
Der erste Schritt bei LDI-PCR ist die Verdauung genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym, das ein Restriktionsfragment erzeugt, das die LINE-1 enthält, die untersucht wird (hier TTC28-LINE-1) und ihr einzigartiges Tag (Abbildung 1). Die verdaute DNA wird dann durch Selbstligation zirkuliert und PCR mit inversen Primern verstärkt, die sich innerhalb des einzigartigen Tags befinden. Auf diese Weise wird die full-length source LINE-1 an ihrer “nativen” Position immer verstärkt und daneben werden auch nachfolgende LINE-1-Einfügungen an verschiedenen Ziel-Loci, die das eindeutige Tag enthalten, verstärkt (Abbildung 1), Rücktranspositionsaktivität der betreffenden LINE-1.
Hier beschreiben wir eine Methode, die verwendet werden kann, um de novo LINE-1 Einfügungen zu identifizieren, die von jeder aktiven LINE-1 von Interesse herrühren. Wir haben diese Methode für eine hochaktive LINE-1 optimiert, die sich bei 22q12.1 befindet, und zuvor gezeigt, dass sie bei der Erkennung subklonaler Insertionen bei Dickdarmkrebs hochsensibel ist14.
Der Erfolg von LDI-PCR hängt von der Qualität der genomischen DNA ab. Daher haben wir einen zusätzlichen Qualitätskontrollschritt aufgenommen, um sicherzustellen, dass zu Beginn des Protokolls hochmolekulare DNA vorhanden ist (Schritt 2.1.2). Wir empfehlen, genomische DNA bei -20 °C für die Langzeitlagerung zu speichern und Aliquots vorzubereiten, um Zyklen des Einfrierens und Auftauens zu vermeiden. Die Verwendung genomischer DNA aus Blut oder patientengerechtem normalem Gewebe wird dringend empfohlen, um zu unterscheiden, ob es sich bei der nachgewiesenen LINE-1-Retrotransposition um eine Keimbahn oder ein somatisches Ereignis handelt. Da Schnittstellen für Restriktionsenzyme im Genom stochastisch sind, ist es möglich, dass eine bestimmte de novo LINE-1-Einsteckstelle keine Schnittstellen für das in seiner Nähe verwendete Restriktionsenzym enthält. Daher sollte mehr als ein Restriktionsenzym in separaten Reaktionen verwendet werden, um die Mehrheit der de novo LINE-1-Einfügungen in tumor-DNA zu erkennen, um verschiedene Bibliotheken kreisförmiger DNA-Vorlagen zu erzeugen. Wenn das einzigartige Tag der LINE-1 von Interesse mehr als einen PAS hat, verbessert die Verwendung von Primerpaaren neben jedem PAS die Wahrscheinlichkeit, stark abgeschnittene Transduktionen zu erkennen.
Obwohl es elegante Methoden zur genomweiten Detektion von de novo LINE-1-Einfügungen gibt, können sie überwältigend sein, wenn das Ziel darin besteht, die Retrotranspositionskompetenz einer bestimmten LINE-1 in einem bestimmten zellulären Kontext zu untersuchen. Zu diesem Zweck kann LDI-PCR ein kostengünstiger und einfacher und dennoch robuster Ansatz zur Visualisierung von LINE-1-Retrotranspositionsereignissen sein. Der in dieser Methode verwendete Targeting-Ansatz ähnelt TS-ATLAS22; LDI-PCR vermeidet jedoch die Verwendung von Linker-Oligonukleotiden und kann sowohl 5- als auch 3-Zoll-Knoten der de novo LINE-1-Einfügung gleichzeitig verstärken. Informationen zu den 5- und 3-Knoten der LINE-1-Einfügung, dem Zielort der Integration, PolyA-Schwanz- und Zielstandortmodifikationen, die alle Kennzeichen der LINE-1-Retrotransposition sind, können durch Kopplung von LDI-PCR mit Einmolekül- lang gelesene Sequenzierungstechnologien. Die so erzeugten langen Lesevorgänge enthalten die eingefügte LINE-1-Sequenz, ihr eindeutiges Tag und die Zielsequenzen in einem einzigen Lesegerät, wodurch Schwierigkeiten bei der Zuordnung von Kurzlesevorgängen im sich wiederholenden Bereich umgangen werden.
Es gibt zwei wesentliche Einschränkungen bei der Verwendung von LDI-PCR zur Erkennung von LINE-1-Aktivitäten. Die erste ist PCR inhärent: Sie kann nur Fragmente mit einer Größe von bis zu 10 kb zuverlässig verstärken. Dies sollte bei der Auswahl von Restriktionsenzymen berücksichtigt werden, da das native Fragment diesen Grenzwert nicht überschreiten sollte. Zweitens kann diese Methode Retrotranspositionsereignisse nur erkennen, die den flankierenden Bereich 3 der LINE-1 durch 3-Transduktionen mobilisieren. Daher wird die Aktivität der LINE-1, die keine 3-Transduktion aufweisen, mit dieser Methode nicht erkannt. Trotz der Verstärkung durch LDI-PCR können einige LINE-1-Retrotranspositionsereignisse, die (a) ein PCR-Ziel ähnlicher Größe wie der “native” Standort oder andere Retrotranspositionen erzeugen oder (b) selten oder subklonal sind, nicht von Agarose-Gel Elektrophorese. Solche LINE-1-Retrotranspositionsereignisse können erfasst werden, indem das LDI-PCR-Produkt mit Einzelnenmolekül-Langlese-Sequenzierungstechnologien14sequenziert wird.
Der hier beschriebene Workflow kann leicht geändert werden, um die Aktivität anderer “heißer” LINE-1s mithilfe eines geeigneten Restriktionsenzyms und durch Das Entwerfen von inversen Primern, die auf diese LINE-1 abzielen, zu erkennen. Neben der Detektion der LINE-1-vermittelten 3–Transduktion kann diese Methode angepasst werden, um weniger häufige LINE-1-vermittelte 5-Transduktionen23zu erkennen. Ähnliche Methode wurden verwendet, um die Integrationsstelle von LINE-1-Reportern in zellbasierten Assays24 und proviralen Integrationsstellen bei Krebs25zu identifizieren. Neben LINE-1-Einfügungen kann diese Methode auch zum Nachweis anderer genomischer Aberrationen eingesetzt werden, wie z. B. DNA-Umlagerungen, bei denen Informationen über die umlagerungsgefährdete Region vor bestehen26.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten uns bei allen unseren Co-Autoren in dem Artikel bedanken, in dem diese Methode zuerst beschrieben wurde14, insbesondere Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, Outi Kilpivaara und Esa Pitkänen für wertvolle Diskussionen während der Entwicklung der Methode. L.K. wird von der Akademie Finnlands (Grant-Nummern 25996, 292789, 306026 und 314394), der Sigrid Juselius Foundation und der Finnischen Krebsgesellschaft finanziert. B.P. ist Stipendiat der University of Helsinki Research Foundation PhD Studentship, ein Doktoratsstipendium der Finnischen Krebsgesellschaft und ein Stipendium für Doktoranden von Ida Montinin Säätiö. Wir danken auch Teemu Masalin (Universität Helsinki) und Kul Shrestha von der Forschungsgruppe von L.K. für die Unterstützung bei der Videoproduktion.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |