면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성
Summary
정형외과 성 인간 간 전이성 포도막 흑색종 이종이식 마우스 모델은 배양된 인간 포도정 흑색종 세포주를 가진 환자 유래 종양 덩어리 및 바늘 주입 기술을 이용한 외과 정형외과 이식 기술을 사용하여 만들어졌습니다.
Abstract
최근 수십 년 동안, 피하 이식 환자 유래 이종이식 종양 또는 배양된 인간 세포주들은 기존의 확립된 인간 세포보다 면역결핍 마우스에서 인간 암을 연구하는 대표적인 모델로 점점 더 인식되고 있다. 선 체외에서. 최근, 정형병 이식 환자 유래 종양 이종이식(PDX) 모델이 마우스에서 개발되어 환자 종양의 특징을 더 잘 복제할 수 있게 되었다. 간 직교 이종이식 마우스 모델은 종양 생물학 및 약물 치료에 대한 통찰력을 제공하는 유용한 암 연구 플랫폼이 될 것으로 예상됩니다. 그러나, 간 정형종양 이식은 일반적으로 복잡하다. 여기에서 우리는 환자 유래 간 전이성 편한 흑색종 종양의 정형외 이식을 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다. 우리는 인간 간 전이성 포도막 흑색종 세포주를 면역 결핍 마우스로 배양했습니다. 프로토콜은 환자 유래 포도막 흑색종 종양의 덩어리를 가진 외과 정형 외과 이식 기술 또는 배양된 인간 세포주를 가진 바늘 주입 기술을 사용하여 일관되게 높은 기술적인 성공률 귀착될 수 있습니다. 우리는 또한 내부 간 종양을 검출하기 위하여 CT 스캐닝을 위한 프로토콜을 기술하고 재착식을 달성하기 위하여 냉동 보존한 종양을 사용하여 재이식 기술을 위해 기술합니다. 함께, 이러한 프로토콜은 번역 연구에서 간 전이성 편한 흑색종의 간 정형 종양 마우스 모델에 대한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
경막 흑색종은 서쪽 세계에 있는 성인 중 가장 일반적인 안구 악성 종양입니다. 과거 50 년 도중, uveal 흑색종 (백만 당 5.1 케이스)의 부각은 미국에 있는 안정되어 남아 있습니다1,2. 경막 흑색종은 홍채, 섬모 체 또는 choroid에 있는 melanocytes에서 생기고, 전이가 발전할 때 극단적으로 치명적인 질병입니다. 경막 흑색종 전이를 가진 환자의 사망률은 전이의 초기 진단 후에 2 년에 1 년에 80%이고 92%이었습니다. 전이와 죽음의 진단 사이 시간은 일반적으로 짧은, 미만 6 개월, 치료에 관하여 없이3,4. 암은 혈액을 통해 퍼지고 간 (89-93 %)4,5. 효과적인 마우스 모형은 간 전이성 경추 흑색종의 추가 조사를 위해 긴급하게 필요합니다. 번역 연구를 위해, 간 국소화한 전이성 전이성 흑색종 마우스 모형을 생성하는 명확한 수요가 있습니다.
환자 유래 종양 이종이식(PDX) 마우스 모델은 개별화된 의학 전략을 제공할 것으로 예상된다. 이러한 모델은 임상 결과를 예측하고, 전임상 약물 평가에 유용할 수 있으며, 종양의 생물학적 연구에 사용될 수 있다6. 대표적인 PDX 모형은 피하 사이트에 종양이 있는 ectopically 종양 이식이 친이종 마우스입니다. 대부분의 연구자들은 특별한 연습없이 피하 이식 에 대한 수술을 할 수 있습니다7,8. 그(것)들은 또한 피하 종양을 쉽게 감시할 수 있습니다. 피하 PDX 모델은 연구 단계에서 인기를 얻었지만 실용화로 전환하는 데 몇 가지 장애물이 있습니다. 피하 이식은 환자 유래 종양이 종양 기원으로부터 다른 미세 환경으로 이식되도록 강제하여 생착 실패 및 느린 종양 성장9,10,11, 12,13,14. 직교 생착은 원래 종양15,16과동일한 장기를 사용하기 때문에 PDX 모델에 대해 보다 이상적이고 합리적인 접근법일 수 있다.
최근에는 환자 유래 간 전이성 흑색종 종양 및 바늘 주사 기법을 NOD에서 배양된 인간 간 전이성 흑색종 세포주로 외과 정형외과 이식 기법을 개발했습니다. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스17,18. 이 프로토콜은 지속적으로 높은 기술적 성공률을 초래합니다. 우리는 또한 내부 간 종양을 검출하는 데 유용한 CT 스캐닝 기술을 확립하고 PDX 플랫폼에서 냉동 보존 종양의 재이식을 개발했습니다. 우리는 경막 흑색종 종양 이종이식 모형이 그들의 조직 병리학및 분자 특징을 포함하여 본래 환자 간 종양의 특성을 유지한다는 것을 것을을 발견했습니다. 함께, 이 기술은 번역 연구에서 경막 흑색종을 위한 간 정형종양 모형을 위한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 의 직교 이종이식 모델은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 만드는 데 비용이 많이 듭니다. 간암을 위한 정형외 종양 이종이식 마우스 모델은19,20,21년 이상 전에 2 년 이상 확립되었다. 그러나 이 기술은 복잡하며 마이크로 니들 홀더 및 6-0 에서 8-0과 같은 특수 장비를 사용해야 합니다. 현미경으로 미세 봉합사. 종양…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고를 검토해 주신 오하라, 케이 사이토, 테라이 에게 감사드립니다. 저자는 폭스 체이스 암 센터에서 박사 R. 사토에 의해이 원고의 편집 및 영어 지원에 대한 비판적 검토를 인정합니다. 본 명세서에 기재된 작품은 보니 크롤 연구기금, 마크 와인지엘 연구기금, 토마스 제퍼슨 대학의 안과 흑색종 연구 기금, 오사카 공동체 재단, JSPS KAKENHI 교부금 JP 18K15596에 의해 지원되었다. 대학. A. Aplin 박사의 실험실에서 연구 NIH 교부금 R01 GM067893에 의해 지원 되었다. 이 프로젝트는 또한 학장의 변형 과학 상에 의해 투자되었다, 토마스 제퍼슨 대학 프로그래밍 이니셔티브 상.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
Referenzen
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Krebsforschung. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Krebsforschung. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Krebsforschung. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
