Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden
Summary
Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.
Abstract
Der Kometentest gewinnt an Popularität als Mittel zur Bewertung von DNA-Schäden in kultivierten Zellen und Geweben, insbesondere nach der Exposition gegenüber Chemikalien oder anderen Umweltstressoren. Die Verwendung des Kometentests bei regulatorischen Tests auf genotoxisches Potenzial bei Nagetieren wurde durch die Annahme einer Testrichtlinie der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) im Jahr 2014 vorangetrieben. Kometen-Assay-Dias werden in der Regel aus frischem Gewebe zum Zeitpunkt der Nekropsie zubereitet; Das Einfrieren von Gewebeproben kann jedoch logistische Herausforderungen vermeiden, die mit der gleichzeitigen Vorbereitung von Dias aus mehreren Organen pro Tier und von vielen Tieren pro Studie verbunden sind. Das Einfrieren ermöglicht auch den Versand von Proben aus der Expositionseinrichtung an ein anderes Labor zur Analyse, und die Lagerung von gefrorenem Gewebe erleichtert das Aufschieben einer Entscheidung über die Generierung von DNA-Schadensdaten für ein bestimmtes Organ. Der alkalische Kometentest ist nützlich, um expositionsbedingte DNA-Doppel- und Einstrangbrüche, alkali-labile Läsionen und Strangbrüche im Zusammenhang mit unvollständiger DNA-Exzisionsreparatur zu erkennen. DNA-Schäden können jedoch auch durch mechanischescheren oder unsachgemäße Probenverarbeitungsverfahren entstehen, was die Ergebnisse des Tests verwirrt. Die Reproduzierbarkeit bei der Entnahme und Verarbeitung von Gewebeproben während der Nekropsien kann aufgrund schwankender Labormitarbeiter mit unterschiedlicher Erfahrung bei der Ernte von Geweben für den Kometentest schwer zu kontrollieren sein. Die Verbesserung der Konsistenz durch Auffrischungsschulungen oder den Einsatz mobiler Einheiten, die mit erfahrenem Laborpersonal besetzt sind, ist kostspielig und möglicherweise nicht immer machbar. Um die konsistente Erzeugung hochwertiger Proben für die Kometen-Assay-Analyse zu optimieren, wurde eine Methode zur Homogenisierung von flashgefrorenen Gewebewürfeln mit einem kundenspezifischen Gewebeminziergerät evaluiert. Proben, die nach dieser Methode für den Kometentest hergestellt wurden, verglichen in der Qualität günstig in der Qualität mit frischen und gefrorenen Gewebeproben, die durch Hacken während der Nekropsie hergestellt wurden. Darüber hinaus wurden niedrige Basis-DNA-Schäden in Zellen aus gefrorenen Gewebewürfeln nach längerer Lagerung gemessen.
Introduction
Der Kometentest wird zunehmend als Mittel zur Bewertung von DNA-Schäden in kultivierten Zellen und Geweben verwendet, die Chemikalien oder anderen Umweltstressoren ausgesetzt sind1. Der Test kann DNA-Doppel- und Einstrangbrüche, alkali-labile Läsionen und einsträngige Brüche im Zusammenhang mit unvollständiger DNA-Reparatur erkennen. Der International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) empfiehlt einen DNA-Strangbruchtest wie den Kometentest als zweiten Test zur Ergänzung des Nagetier-Erythrozyten-Mikrokern-Assays zur Beurteilung der In-vivo-Genotoxizität und als Folgetest zur Beurteilung der Wirkungsweise in Zielorganen der Tumorinduktion2. Die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) empfiehlt den In-vivo-Kometentest als geeigneten Folgetest zur Untersuchung der Relevanz eines positiven Ergebnisses in einem In-vitro-Genotoxizitätstest3. Im Jahr 2014 wurde eine OECD-Testrichtlinie für den Nagetierkometentest genehmigt, wodurch die Akzeptanz des Assays für die Anwendung bei regulatorischen Tests des genotoxischen Potenzials erhöht wurde. Der Test basiert auf der elektrophoretischen Trennung von entspannten DNA-Schleifen und Fragmenten, die aus Nukleoiden von lysierten Zellen wandern. Grundsätzlich sind einzelne Zellen in Agarose eingebettet, die auf Mikroskopschlitten geschichtet wurde. Die Dias werden dann in den Lysepuffer eingetaucht, gefolgt von einer alkalischen (pH > 13) Lösung, die es der fest gewickelten Kern-DNA ermöglicht, sich zu entspannen und zu entspannen. Dias werden dann in ein elektrisches Feld gelegt, das die Migration negativ geladener DNA zur Anode stimuliert und Bilder erzeugt, die Kometen ähneln; die relative MENGE der DNA im Kometenschweif im Vergleich zum Kometenkopf ist direkt proportional zur Menge der DNA-Schäden; DER DNA-Gehalt im Schwanz wird in der Regel mit hilfe digitaler Bildgebungssoftware quantifiziert.
Da der Kometentest fragmentierte DNA erkennt, kann eine genaue Quantifizierung von expositionsinduzierten DNA-Schäden durch Chromatinfragmentierung im Zusammenhang mit Nekrose oder Apoptose infolge behandlungsinduzierter Zytotoxizität oder Stress verwirrt werden. Darüber hinaus kann eine DNA-Schädigung durch mechanisches Scheren oder unsachgemäße Probenbearbeitung auftreten4. Die Bedeutung der Aufrechterhaltung des vor der Folienvorbereitung gekühlten Erntegewebes zur Minimierung des Ausgangsniveaus der DNA-Schäden wurde bereits5,6gezeigt. Viele Laboratorien bereiten Kometenasssay-Dias aus frischem Gewebe vor; Dies kann jedoch logistisch eine Herausforderung darstellen, wenn diaginen von mehreren Gewebetypen pro Tier in einer Studie mit einer großen Anzahl von Tieren vorbereitet werden. Darüber hinaus stellt dies ein Problem dar, wenn die Vorbereitung und Analyse von Dias in einem entfernten Labor erfolgen soll, was den Versand von Proben erforderlich macht. Zum Beispiel umfasst das U.S. National Toxicology Program den Kometentest als Bestandteil seines genetischen toxikologischen Testprogramms (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) und nimmt den Assay manchmal in 28 oder 90-Tage-Studien zur Toxizität bei wiederholter Totdosis auf; dies erfordert die Entnahme von Gewebe durch das Labor im Leben und die Übertragung von Proben in ein anderes Labor zur Analyse. Um dies zu erreichen, werden Gewebeteile gehackt und/oder Epithelzellen des Magen-Darm-Traktes abgekratzt und Zellsuspensionen werden eingefroren und in einem Gefrierschrank für die nachfolgende Verbringung und Lagerung durch das empfangende Labor bis zur Analyse7gelagert. Die ordnungsgemäße Handhabung von Proben ist entscheidend für die Beschaffung hochwertiger Daten mit gefrorenem Gewebe; Reproduzierbare Manipulation von Gewebeproben während Nekropsien, die von ständig wechselndem Personal durchgeführt werden, ist jedoch schwer zu kontrollieren, insbesondere in Labors, die nicht routinemäßig Gewebe für den Kometentest ernten. Die Auffrischung des Nekropsiepersonals oder die Nutzung einer mobilen Einheit, die von erfahrenem Laborpersonal besetzt ist, um frische oder gefrorene Gewebeproben zu sammeln, ist oft zu kostspielig, nicht durchführbar oder einfach unterbewertet.
Um eine konsistente Generierung hochwertiger Gewebeproben für die Übertragung an einen entfernten Ort für kometenassatoume Analysen zu gewährleisten, wurde der Nutzen einer veröffentlichten Methode6 der Gewebekonservierung aus eingefrorenen Flash-Gewebewürfeln untersucht. Bei dieser Methode werden gefrorene Gewebewürfel in eine Gewebeminkvorrichtung aus Edelstahl(Abbildung 1) geladen, die in ein Mikrozentrifugenrohr mit Kaltpuffer gelegt wird. Der Gewebewürfel wird dann durch ein kleines Messnetz am Ende des Geräts geschoben. Das wiederholte Zwingen der Gewebesuspension durch das Netzsieb in beide Richtungen führt zu einer relativ gleichmäßigen einzelzelligen Suspension. Proben, die mit dieser Methode hergestellt wurden, verglichen in der Qualität sowohl mit frischen als auch gefrorenen Gewebeproben, die durch Hacken hergestellt wurden. Als zusätzlichen Vorteil, im Gegensatz zu Hackfleischproben, Gewebewürfel können gefroren für längere Zeit gelagert werden und dennoch qualitativ hochwertige Ergebnisse in der Kometen-Assay liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie bereits gezeigt7,12,13, richtig behandelt Flash gefrorenes Hackfleisch liefert gute Ergebnisse in der Kometen-Assay. Tatsächlich liegen die in unserem Labor hergestellten Basiswerte für gefrorene gehackte Ratten- und Mausleber in der Regel bei 6 %, wie in der OECD-Testrichtlinie9 für frisch gehackte Leberproben von Ratten empfohlen. Gute Ergebnisse wurden von mehreren Laboratorien mit einer Vielzah…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind Lincoln Martin und Kelley Owens für die fachkundige technische Hilfe bei der Vorbereitung und Bewertung von Kometenrutschen und Dr. Carol Swartz für die Durchführung statistischer Analysen dankbar. Die Autoren würdigen auch die unterstützenden Beiträge von Mitgliedern der Programme Genetic Toxicology, Investigative Toxicology, and Necropsy an der ILS.
Materials
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL ) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL ) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
Referenzen
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
