Summary
التعميم RNAs (circRNAs) هي غير الترميز RNAs التي قد يكون لها ادوار في التنظيم عبر المعاقين والتوسط التفاعلات بين البروتينات. بعد تقييم المعلمات المختلفة لبناء مكتبات التسلسل circRNA ، تم تجميع بروتوكول باستخدام مجموع تقطعت بهم السبل الجيش النيبالي اعداد المكتبة مع RNase R ما قبل العلاج ويرد هنا.
Abstract
التعميم RNAs (circRNAs) هي فئة من غير الترميز RNAs المشاركة في وظائف بما في ذلك مايكرو الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) التنظيم ، والوساطة من التفاعلات بروتين البروتين ، وتنظيم النسخ الجيني الابويه. في الجيل التالي الكلاسيكية RNA تسلسل (RNA-seq) ، يتم تجاهل circRNAs عاده نتيجة لاختيار بولي-A اثناء بناء المكتبات mRNA ، أو وجدت في وفره منخفضه جدا ، التالي من الصعب عزل وكشف. هنا ، تم تحسين بروتوكول إنشاء مكتبه circRNA عن طريق مقارنه مجموعات اعداد المكتبة ، وخيارات ما قبل العلاج ومختلف الكميات الاجماليه لإدخال الحمض الريبي النيبالي. وقد تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبة المتاحة تجاريا ، مع وبدون RNase R قبل المعالجة ، وباستخدام كميات متغيرة من إجمالي دخل الحمض الريبي النيبالي (1 إلى 4 ميكروغرام). وأخيرا ، أنواع متعددة من الانسجه ؛ بما في ذلك الكبد, الرئة, العقدة الليمفاوية, والبنكرياس; فضلا عن مناطق الدماغ متعددة; بما في ذلك المخيخ ، والفص الجداري السفلي ، والجيروسكوبات الصدغية الوسطي ، والقشرة القذالي ، والجيروسكوبات الاماميه المتفوقة. تمت مقارنتها لتقييم وفره circRNA عبر أنواع الانسجه. تحليل البيانات التي تم إنشاؤها الحمض الريبي-seq باستخدام سته مختلفه circRNA أدوات الكشف (find_circ ، CIRI ، Mapsplice ، سكين ، DCC ، و سيرسيكسبلورير) كشفت ان مجموعه من الجيش النيبالي السماوي اعداد مكتبه مجموعه عده مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام الحمض الريبي المدخلات هو الأمثل طريقه لتحديد العدد النسبي الأعلى من circRNAs. وتماشيا مع النتائج السابقة ، لوحظت اعلي نسبه إثراء في انسجه المخ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.
Introduction
التعميم rnas (circrnas) هي الذاتية ، وغير الترميز rnas التي اكتسبت الاهتمام نظرا لتعبيرها المتفشي في الناسخة النواة1،2،3. يتم تشكيلها عندما الاكسون العودة لصق لبعضها البعض ، التالي اعتبرت في البداية ان تكون التحف الربط4،5. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات الاخيره ان circrnas المعرض نوع الخلية ، والانسجه ، والتنمية المرحلة المحددة التعبير3،6 ويتم الحفاظ علي التطور2،3. وعلاوة علي ذلك ، فهي تشارك في الوساطة من البروتين والبروتين التفاعلات7، الصغرى الحمض الريبي النيبالي (ميرنا) ملزمه3،8،9،10، وتنظيم النسخ الجيني الابويه11.
في تسلسل RNA الكلاسيكية (الحمض الريبي النيبالي-seq) ، circRNAs قد تكون فقدت تماما اثناء بناء المكتبة نتيجة لاختيار بولي-A ل mRNAs أو قد يكون من الصعب عزل نظرا لوفره منخفضه. ومع ذلك ، فقد أدرجت الدراسات الحديثة لتوصيف الخصائص خطوه ما قبل المعالجة باستخدام rnase R من أجل إثراء circrna2،12،13. RNase R هو اكسوريبونوكليسي التي يهضم RNAs الخطية ، تاركا وراءها هياكل الحمض الريبي النيبالي الدائري. تم تحسين بروتوكولات التخصيب CircRNA عن طريق توليد ومقارنه البيانات من اثنين المتاحة تجاريا مجموعات البناء مكتبه النسخ ، مع وبدون خطوه RNase R قبل العلاج ، واستخدام كميات متفاوتة من الدخل الكلي RNA (1 إلى 4 ميكروغرام). وكان البروتوكول الأمثل تستخدم المقبل لتقييم وفره من circRNAs عبر خمس مناطق الدماغ المختلفة (المخيخ [BC] ، الفص الجداري السفلي [الملكية الفكرية] ، الجيروسكوب الصدغي الأوسط [MG] ، القشرة القذالي [OC] والجيروسكوب الامامي المتفوق [SF]) وأربعه أنواع أخرى من الانسجه (الكبد [LV] ، الرئة [LU] ، العقدة الليمفاوية [LN] والبنكرياس [PA]). وكانت المكتبات التي تليها الحمض الريبي النيبالي-المتسلسلة المتعاقبة وتحليل البيانات باستخدام سته مختلفه خوارزميات التنبؤ circRNA: find_circ3، ciri14، mapsplice15، سكين16، dcc17، و سيرسيكسبلورير18. واستنادا إلى تحليلنا ، تم الكشف عن أكبر عدد من circRNAs فريدة من نوعها عند استخدام مجموعه من الذين تقطعت بهم السبل اعداد مكتبه الحمض الريبي النيبالي مع RNase R قبل العلاج و 4 ميكروغرام إجمالي المدخلات RNA. يتم وصف البروتوكول الأمثل هنا. كما ذكر سابقا19,20, لوحظ اعلي إثراء من circrnas في الدماغ بالمقارنة مع أنواع الانسجه الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد اجري هذا البحث امتثالا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان. وقد تم الحصول علي انسجه المخ من برنامج التبرع بالمخ والجسم لمعهد البحوث الصحية في صن سيتي ، AZ. وتتم الموافقة علي عمليات برنامج التبرع بالمخ والجسم من قبل مجلس المراجعة المؤسسية الغربية (بروتوكول WIRB #20120821). وقد وقعت جميع الموضوعات أو ممثلوها القانونيون علي الموافقة المستنيرة. تم شراء التجارية (غير الدماغ) بيوبيبيكس من بروتيجينيكس.
1. RNase R العلاج
ملاحظه: في الخطوات التالية ، يتم ضبط وحده التخزين رد الفعل إلى حجم إجمالي 50 μL. هذا هو الحد الأدنى لحجم العينة لاستخدامها في تنظيف RNA & مجموعه المكثف (انظر جدول المواد). بالاضافه إلى ذلك ، فان البروتوكول الأمثل الموصوف هنا هو لكميه الإدخال من 4 ميكروغرام من الحمض الريبي النيبالي الإجمالي. ويوصي بوقت حضانة أطول لعلاج RNase R لكميه المدخلات > 4 ميكروغرام.
- تمييع إجمالي RNA إلى 4 ميكروغرام في 39 μL RNase خاليه من المياه في أنبوب الطرد المركزي وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب.
- في أنبوب منفصل ، تمييع R RNase إلى تركيز العمل من 2 U/μL مع 1x RNase R رد فعل العازلة. جعل فقط ما يكفي للاستخدام الفوري.
- ماصه 39 μL من إجمالي RNA و 5 μL من 10x RNase R رد فعل العازلة في أنبوب رد فعل مل 1.5 وتخلط جيدا عن طريق التنضيد (50 μL سيكون حجم التفاعل الكلي). المقبل ، أضافه 6 μL من RNase R (2 U/μL).
- اضبط الماصة علي حجم التفاعل الكامل (50 μL) واخلط جيدا بواسطة التنضيد لاعلي ولأسفل 10 مرات.
- ضع الأنبوب في حمام مياه 37 درجه مئوية لمده 10 دقائق. تاكد من ان حجم التفاعل الكامل مغمورة في حمام المياه.
- وضع أنبوب علي الجليد والمضي قدما علي الفور مع الحمض الريبي النيبالي تنظيف & تركيز (القسم 2).
2. تنقيه RNA باستخدام الحمض الريبي النيبالي تنظيف والمكثف كيت
ملاحظه: عند استخدام عاليه الجودة RNA (رين > 8 ، DV200 > 80 ٪) ، RNase R العلاج قد يؤدي إلى فقدان ما يقرب من 60 ٪ من الحمض الريبي النيبالي. باستخدام إدخال 4 ميكروغرام, ويقدر ان 2 – 2.5 ميكروغرام من الحمض الريبي النيبالي المعالج تركت بعد القسم 1.
- قبل البدء ، واعداد المخزن المؤقت للغسيل الحمض الريبي النيبالي باضافه 48 mL من 100 ٪ الايثانول إلى المركز العازل وتخلط جيدا عن طريق التنضيد. وضع أعمده تنقيه في أنابيب جمع (انظر جدول المواد) ومكان في رف أنبوب.
ملاحظه: استخدم الإعدادات الطردة التالية لكافة الخطوات التالية: 10000 – 16000 x g. إذا تم تنفيذ العلاج DNase انا بالفعل ، تخطي DNase انا العلاج في هذه المرحلة. - أضافه 2 مجلدات من الحمض الريبي النيبالي ربط العازلة إلى RNase R العينة المعالجة ، وتخلط جيدا عن طريق التنضيد (الحجم الكلي: 150 μL).
- أضافه 1 حجم 100 ٪ الايثانول إلى المخزن المؤقت لتجليد الحمض الريبي النيبالي والمعالجة RNase R خليط عينه ، وتخلط جيدا عن طريق التنضيد (الحجم الكلي: 300 μL).
- نقل وحده التخزين بالبالكامل إلى العمود والطرد المركزي العمود لمده 30 ثانيه. تجاهل التدفق من خلال.
- أضافه 400 μL من الجيش النيبالي المؤقت الاعداديه العازلة مباشره إلى العمود ، الطرد المركزي العمود لمده 30 ثانيه ، وتجاهل التدفق من خلال.
- أضافه 700 μL من الحمض الريبي النيبالي غسل المخزن المؤقت مباشره إلى العمود ، الطرد المركزي العمود لمده 30 ثانيه ، وتجاهل التدفق من خلال.
- أضافه 400 μL من الحمض الريبي النيبالي غسل العازلة مباشره إلى العمود ، الطرد المركزي العمود لمده 2 دقيقه ، ونقل العمود إلى جديد RNase خاليه من أنبوب 1.5 mL.
- أضافه 11 μL من المياه RNase خاليه مباشره إلى العمود عن طريق عقد غيض الماصة فوق فلتر العمود وضمان ان المياه الأراضي فقط علي فلتر العمود.
- احتضان العمود لمده دقيقه واحده في درجه حرارة الغرفة والطرد المركزي لمده دقيقه واحده.
- قبل التخلص من العمود ، تحقق من التدفق من خلال الأنبوب الخالي من RNase. إذا كان التملص ناجحه ، تخزين العينة في-80 درجه مئوية أو المضي قدما فورا مع اعداد المكتبة. ويستخدم الحجم النهائي الإجمالي لما يقرب من 10 μL لبناء المكتبة.
ملاحظه: نقطه التوقف: اترك RNA في-80 درجه مئوية لمده تصل إلى 7 أيام قبل المتابعة مع اعداد المكتبة.
3. الاعداديه مكتبه circRNA
ملاحظه: انظر جدول المواد لعده ، والذي يحتوي علي معظم الكواشف المستخدمة في هذا القسم.
- استنفاد الجيش الريبي النيبالي وتفتيته
- نقل 10 μL من الحمض الريبي النيبالي المنقي من الخطوة 2.10 إلى بئر نظيفه في لوحه جديده 96-بئر 0.3 mL PCR. إلى البئر ، أضافه 5 μL من المخزن المؤقت ربط rRNA متبوعا 5 μL rRNA أزاله ميكس. ماصه بلطف صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط.
- ختم لوحه واحتضان لمده 5 دقائق في 68 درجه مئوية علي المبرمجة مسبقا ، قبل تسخينها كتله ثيرموسيكلير. بعد الانتهاء من الحضانة 5 دقائق ، مكان لوحه علي مقاعد البدلاء واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 1 دقيقه.
- أزاله الختم من لوحه. أضافه 35 μl من فورتيكسد درجه حرارة الغرفة rrna أزاله الخرز للعينه. اضبط الماصة علي 45 μL والماصة لاعلي ولأسفل 10 – 20x للمزج جيدا. لوحه احتضان لمده دقيقه واحده في درجه حرارة الغرفة.
- نقل لوحه إلى موقف المغناطيسي واحتضان علي الوقوف لمده دقيقه واحده أو حتى يتم مسح الحل. نقل كل من ماده طافي (~ 45 μl) إلى بئر جديده علي نفس لوحه ، أو لوحه جديده (اعتمادا علي عدد العينات التي تعمل مع).
- دوامه الخرز تنظيف الحمض الريبي النيبالي (انظر جدول المواد) حتى تفرق جيدا ، وأضافه 99 μl من الخرز لكل عينه. ماصه لاعلي ولأسفل 10x لخلط. احتضان لوحه في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه.
- نقل لوحه إلى موقف المغناطيسي واحتضان اضافيه 5 دقيقه أو حتى يتم مسح الحل. أزاله وتجاهل كل من ماده طافي من البئر.
- مع لوحه لا تزال علي الحامل المغناطيسي ، أضافه 200 μL من الطازجة المعدة 80 ٪ EtOH إلى البئر دون تعطيل الخرز. احتضان لمده 30 ثانيه ، ثم أزاله وتجاهل الايثانول. كرر لما مجموعه 2 يغسل.
- أضافه 11 μL من العازلة لكل بئر وماصه اعلي وأسفل 10 مرات لخلط. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 2 دقيقه ، ومن ثم نقل إلى الموقف المغناطيسي حتى مسح الحل (1-5 دقيقه).
- نقل 8.5 μl من ماده طافي من البئر إلى بئر جديده علي نفس لوحه أو لوحه جديده. أضافه 8.5 μL من Elute ، التمهيدي ، قطعه مزيج عاليه لكل عينه تحتوي علي جيدا. ماصه لاعلي ولأسفل 10 مرات لخلط جيدا.
- ختم لوحه واحتضان لمده 8 دقائق في 94 درجه مئوية علي المبرمجة مسبقا ، قبل تسخينها كتله ثيرموسيكلير. أزاله من ثيرموسيكلير عندما يصل إلى 4 درجه مئوية والطرد المركزي لفتره وجيزة.
ملاحظه: المضي قدما علي الفور إلى توليف الأول حبلا cDNA بروتوكول.
- توليف cDNA
- لكل عينه يجري اعدادها ، مزيج 9 μL الأول ستراند مزيج التوليف مع 1 μL من النسخ العكسي (انظر جدول المواد). أضف 8 ميكرولتر من الخليط إلى العينة. ماصه لاعلي ولأسفل 6 مرات لخلط.
- ختم لوحه واحتضان علي المبرمجة مسبقا ، ثيرموسيكلير كتله قبل تسخينها باستخدام المعلمات التالية: 25 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، 42 درجه مئوية لمده 15 دقيقه ، 70 درجه مئوية لمده 15 دقيقه ، 4 درجه مئوية عقد. المضي قدما علي الفور إلى التوليف حبلا الثاني.
- أضافه 5 μL من المخزن المؤقت أعاده التعليق إلى كل عينه متبوعا 20 μL من الثانية ستراند بمناسبه مزيج رئيسي. ماصه الصوت بأكمله صعودا وهبوطا 6 مرات.
- ختم لوحه واحتضانها علي المبرمجة مسبقا ، قبل تسخينها كتله ثيرموسيكلير مجموعه إلى 16 درجه مئوية لمده 1 ساعة. بعد الحضانة ، وأزاله لوحه من ثيرموسيكلير والسماح لها تتوازن درجه حرارة الغرفة.
- دوامه الخرز تنقيه PCR (انظر جدول المواد) وأضافه 90 μl الخرز لكل بئر من عينه. ماصه لاعلي ولأسفل 10 مرات لخلط جيدا. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه.
- انقل مزيج الخرزة/العينة إلى الحامل المغناطيسي وحضنه لمده 5 دقائق أو حتى يزول السائل. أزاله وتجاهل supernatant.
- أضافه 200 μL من 80% EtOH إلى كل عينه. احتضان العينات علي الحامل المغناطيسي في درجه حرارة الغرفة لمده 30 ثانيه. تجاهل الفائقة. كرر 1x.
- السماح الخرز لتجف في درجه حرارة الغرفة لمده 6 دقائق ، ومن ثم أزاله من موقف المغناطيسي.
- أعاده تعليق الخرز في 19.5 μL من المخزن المؤقت أعاده التعليق. ماصه لاعلي ولأسفل 10 مرات لخلط جيدا. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 2 دقيقه ، ثم نقل إلى موقف المغناطيسي واحتضان لمده اضافيه 1 دقيقه أو حتى مسح السائل.
- نقل 17.5 μl من ماده طافي إلى جديده جيدا/لوحه جديده.
ملاحظه: إذا لم يتم القيام بذلك علي الفور ، يمكن تخزين العينات عند-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 7 أيام.
- لكل عينه يجري اعدادها ، مزيج 9 μL الأول ستراند مزيج التوليف مع 1 μL من النسخ العكسي (انظر جدول المواد). أضف 8 ميكرولتر من الخليط إلى العينة. ماصه لاعلي ولأسفل 6 مرات لخلط.
- اعداد المكتبة
- أضافه 12.5 μL من A-المخلفات ميكس لكل المحتوية علي البئر supernatant. ماصه الحجم بأكمله صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط.
- احتضان رد فعل علي المبرمجة مسبقا ، ثيرموسيكلير كتله قبل تسخينها تعيين إلى 37 درجه مئوية باستخدام المعلمات التالية: 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه ، 70 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، 4 درجه مئوية عقد. عندما تصل العينات إلى 4 درجات مئوية ، انتقل فورا إلى ربط المحول.
- لكل عينه أضافه 2.5 μL من المخزن المؤقت أعاده التعليق ، 2.5 μL من محول RNA فريدة ، و 2.5 μL من مزيج الربط. ماصه لاعلي ولأسفل 10x لخلط.
- احتضان عينات علي المبرمجة مسبقا ، قبل تسخينها كتله ثيرموسيكلير في 30 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
- أضافه 5 μL من إيقاف الربط العازلة لكل عينه وماصه لاعلي وأسفل لخلط.
- أضافه 42 μL من الخرز تنقيه PCR مختلطة لكل عينه وتخلط جيدا. اتبع الخطوات ال3.2.6ه من خلال 3.2.10 ، ولكن تغيير وحده التخزين أعاده التعليق إلى 52 μL ووحده التخزين النهائية التملص إلى 50 μL.
- كرر بروتوكول الخرزة تنقيه PCR مره أخرى مع 50 μL التملص من 3.3.6 الخطوة ، ولكن تغيير حجم أعاده التعليق إلى 22 μL وحجم الشطف النهائي إلى 20 μL.
ملاحظه: إذا لم يتم القيام بذلك علي الفور ، يمكن تخزين العينات عند-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 7 أيام. - أضافه 5 μL من PCR التمهيدي كوكتيل و 25 μL من PCR ماستر ميكس لكل عينه. امزجها بالأنابيب لاعلي ولأسفل 10 مرات. احتضان رد فعل علي المبرمجة مسبقا ، ثيرموسيكلير كتله قبل تسخينها باستخدام المعلمات التالية: 98 درجه مئوية لمده 30 ثانيه ؛ ثم 8 دورات من 98 درجه مئوية ل 10 ق ، 60 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، و 72 درجه مئوية ل 30 ثانيه ؛ ثم 72 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، ثم 4 درجه مئوية عقد.
ملاحظه: قد تكون هناك حاجه إلى الاستفادة المثلي من العدد الإجمالي لدورات PCR لتوليد كميات كافيه من المكتبة للتسلسل. - اتبع البروتوكول لتنقيه الخرزة PCR (الخطوات من خلال 3.2.9) ، باستثناء أضافه 50 μL من الخرز تنقيه PCR مختلطة جيدا وتغيير حجم أعاده التعليق إلى 32.5 μL مع حجم التملص النهائي من 30 μL.
ملاحظه: يجب تخزين العينات عند-20 درجه مئوية.
- القياس الكمي ومراقبه الجودة باستخدام محلل الأحماض النووية
- السماح الاشرطه والكواشف لتتوازن في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه.
- مزيج 2 μL من المكتبة مع 2 μL من HS D1000 العازلة ، وأضافه إلى لوحه متوافقة جيدا.
- ختم باحكام مع ختم إحباط متوافق ، ودوامه لمده 1 دقيقه في 2,000 لفه في الدقيقة.
- تدور أسفل وتحميل لوحه علي محلل البرامج التالية المطالبات.
ملاحظه: يجب ان تكون المكتبات تقريبا 260 bp في الحجم.
4. سير عمل تحليل البيانات
- تسلسل الشركات التابعة للجيش النيبالي المتسلسل (انظر جدول المواد) لإنشاء 82 bp المقترنة-نهاية القراءة. تحويل بيانات التسلسل الاوليه في شكل ملفات basecall (.bcl) إلى FASTQs باستخدام الاداه bcl2fastq (v 0.2.19).
- الكشف عن circRNAs.
ملاحظه: استنادا إلى الادله التي سبق الإبلاغ عنها ان أسلوب الكشف circrna الفرقة أداء أفضل مقارنه باستخدام أداه الكشف واحد21،22، نقترح استخدام أدوات متعددة للكشف circrna. هنا ، تم تحديد circRNAs باستخدام ست خوارزميات التنبؤ Circrnas القائمة: find_circ ، CIRI ، سيرسيكسبلورير ، Mapsplice ، سكين ، و DCC ، تطبيق إعدادات المعلمة الموصي بها لكل خوارزميه.- تحميل وتثبيت كل خوارزميه الكشف circRNA علي كتله الحوسبة عاليه الأداء لينكس باستخدام الإرشادات المقدمة من قبل المطورين.
- محاذاة العلامات السريعة المتسلسلة RNA ضد الجينوم المرجعي (GRCh37) ، باستخدام التقويم الموصي به لكل أداه.
- بعد المحاذاة ، تنفيذ خوارزميات الكشف circRNA عن طريق تطبيق إعدادات المعلمة الموصي بها الخاصة بهم.
- ستقوم كل أداه بإخراج ملف نتائج متعدد الاعمده مع قائمه circRNAs المكتشفة ، واستخراج إحداثيات Circrnas وعدد القراءات الداعمة من هذا من أجل تحديد عدد المرشحين المكتشفين في كل عينه/حاله اختبار.
- تحويل الإخراج الإحداثيات circRNA بواسطة CIRI و Mapsplice و DCC إلى الإحداثيات المستندة إلى 0 ان تكون متناسقة مع خوارزميات الثلاثة الأخرى.
- حدد circRNAs مع اثنين أو أكثر من القراءات الداعمة أو التحليلات والمقارنات النهائية. يلخص الجدول 1 جميع المعلمات التي تم تقييمها في دراستنا إلى جانب العدد الإجمالي للقراءة المتسلسلة التي تم إنشاؤها لكل عينه.
- لكل نموذج/اختبار الشرط ، عد عدد المكتشفة circRNAs تطبيع إلى عدد القراءات المعينة التي تم إنشاؤها لتلك المكتبة ، لكل مليون. تلخيص النتائج عبر مختلف الاداات/العينات في المؤامرات مربع ، كما هو مفصل في نتائج الممثل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تقييم البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام السيطرة العالمية المتاحة تجاريا RNA (UC) واستخدام مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبة ، وكلاهما يتضمن خطوه لاستنفاد الأوزون في بروتوكولاتهما. باستخدام سير عمل تحليلي (سير عمل تحليل البيانات ، القسم 4) ، بشكل عام ، تم الكشف عن عدد أكبر من circRNAs في مجموعات بيانات دعامات بالمقارنة مع Kapa (الشكل 1). وعلي الرغم من ان النسب المئوية لل RNA الريبي (rRNA) كانت اقل من 5 في المائة في مجموعات البيانات من كلتا المجموعتين بالنسبة لكميات المدخلات المنخفضة (1 ، 2 ميكروغرام) ، فان مجموعات بيانات Kapa كانت اعلي من المحتوي rRNA للمدخلات 4 و 5 و 10 ميكروغرام التالي ، استنادا إلى عدد من الكشف عن circRNAs و rRNA كفاءه استنفاد ، أجريت المزيد من التجارب باستخدام عده دعامات.
بعد ذلك ، تم اختبار اهميه RNase R قبل المعالجة عن طريق مقارنه البيانات المتولدة من RNase R قبل المعالجة والمكتبات غير المعالجة مسبقا. وتحقيقا لهذه الغاية ، تم استخراج الحمض الريبي النيبالي الإجمالي من MG من الافراد المسنين الأصحاء وتسلسل البيانات المتولدة من المكتبات مع (N = 3) وبدون (N = 3) قبل المعالجة باستخدام RNase R23 تمت مقارنتها. وتم التعرف باستمرار علي عدد أكبر من circRNAs في المكتبات المعالجة مسبقا بالمقارنة مع المكاتب غير المعالجة مسبقا (الشكل 2). ومن المتوقع ان يقوم العلاج المسبق بازاله RNAs الخطي ، التالي إثراء أنواع circRNA.
ثالثا ، تم اختبار كميه الحمض الريبي الذي سيكون الإدخال الأمثل للكشف عن تنوع اعلي من circRNAs. وقد أعدت المكتبات باستخدام 1 ، 2 ، و 4 ميكروغرام من إجمالي الحمض الريبي الذي تم استخراجه من المناطق الدماغية MG ، OC ، و SF ، وكذلك الجيش النيبالي الموحد. مقارنه وفره من circRNAs المكتشفة من كل مكتبه ، ولوحظ التنوع الأعلى من الأنواع Circrnas عند استخدام الحمض الريبي النيبالي إدخال 4 ميكروغرام مقارنه مع 2 و 1 ميكروغرام (الشكل 3) ، كما ينعكس في عدد circrnas فريدة من نوعها المحددة. تحذير واحد ان نلاحظ انه علي الرغم من ان أوقات الحضانة المختلفة خلال RNase R لم يتم اختبار العلاج ، وهو اتجاه حيث تم الكشف عن عدد متزايد من circRNAs عبر المدخلات RNA الإجمالي من 1 إلى 4 ميكروغرام لوحظ عند السيطرة علي جميع المعلمات الأخرى.
ثم تم تطبيق هذا البروتوكول الأمثل عبر أنواع متعددة من الانسجه لمقارنه circRNA وفره. خمسه مناطق الدماغ, بما في ذلك قبل الميلاد, مغ, OC, IP, و SF, من أربعه من الافراد المسنين الأصحاء, تم اختبار, مع أربعه أنواع أخرى من الانسجه, بما في ذلك LV, LU, LN والسلطة الفلسطينية, من سته المتبرعين صحية. وعموما ، لوحظ وجود وفره أكبر من السيكرناس في المخ مقارنه بأنواع الانسجه الأخرى (الشكل 4) ، كما ذكر سابقا في19و20.
الشكل 1: كشف CircRNA باستخدام دعامات Kapa مجموع الحمض الريبي النيبالي. تم إنشاء تسلسل البيانات ل RNA الجيش النيبالي الموحد باستخدام مجموعتين منفصلتين مجموع اعداد مكتبه الجيش النيبالي الريبي ، مع كل 1 ، 2 ، 4 ، 5 ، و 10 ميكروغرام إدخال الحمض الريبي النيبالي والري الريبي الخلوي R (RNase R) قبل المعالجة. تم تطبيع عدد circRNAs التي تم الكشف عنها بواسطة الاداات في كل نموذج إلى عدد القراءات المعينة ، لكل مليون (المحور ص). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكشف عن CircRNA مع وبدون RNase R المعالجة المسبقة. تم استخدام تسلسل البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام مجموعه دعامات للمقارنة بين تاثير RNase R المعالجة المسبقة. تم استخراج الحمض الريبي النيبالي من الجيروسكوبات المتوسطة الزمانيه (MG) من الضوابط الصحية للمسنين لهذا التحليل. تم حساب العدد الذي تمت تسويته من circRNAs (المحور ص) بشكل مشابه لشكل 1. RNase R + = قبل التعامل مع RNase R ، RNase R-= لا قبل التعامل مع RNase r. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الكشف CircRNA باستخدام كميه مختلفه من الحمض الريبي للإدخال. باستخدام الحمض الريبي النيبالي المستخرج من MG ، القشرة القذالي (OC) ، والجيروسكوبات الاماميه متفوقة (SF) ، فضلا عن الحمض الريبي النيبالي ، وعدد من circRNAs فريدة من نوعها الكشف عند استخدام 1 ، 2 ، و 4 ميكروغرام من الحمض الريبي للإدخال ، تمت مقارنه كل مكتبه. تم حساب العدد الذي تمت تسويته من circRNAs (المحور ص) بشكل مشابه لشكل 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكشف عن CircRNA في الدماغ مقابل أنواع الانسجه الأخرى. وقد تم التخصيب CircRNA بها باستخدام عده دعامات ايمينا مع RNase R ما قبل العلاج و 4 ميكروغرام من الدخل الكلي الحمض الريبي النيبالي. تمثل المؤامرات المربعة عدد circRNAs المكتشفة من قبل ثلاثه علي الأقل من الاداات الستة عبر العينات من كل منطقه الدماغ/نوع الانسجه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| اختبار # | تقييم المعلمة | شروط الاختبار | مصدر العينة | كميه المدخلات/الشروط/العينات المختبرة | إجمالي عدد مرات قراءه التسلسل |
| 1 | طقم اعداد المكتبة | [ايلومينا] [تروفس] تقطعت إجماليه [رنا] [فس.] [روش] Kapa مجموع [رنا] مجموعه | Uc | دعامات: 1 ميكروغرام | 8, 91, 46128 |
| دعامات: 2 ميكروغرام | 7, 93, 90202 | ||||
| دعامات: 4 ميكروغرام | 6, 66, 12238 | ||||
| دعامات: 5 ميكروغرام | 7, 88, 56902 | ||||
| دعامات: 10 ميكروغرام | 6, 61, 06874 | ||||
| Kapa: 1 ميكروغرام | 8, 83, 95496 | ||||
| Kapa: 2 ميكروغرام | 10, 66, 59272 | ||||
| Kapa: 4 ميكروغرام | 10, 62, 34954 | ||||
| Kapa: 5 ميكروغرام | 7, 47, 75914 | ||||
| Kapa: 10 ميكروغرام | 11, 00, 68504 | ||||
| 2 | المعالجة المسبقة | RNase R قبل المعالجة مقابل غير المعالجة المسبقة | ملغ | Pair1: MG_1 (RNase R +) | 10, 76, 09934 |
| Pair1: MG_5 (RNase R-) | 9, 62, 15516 | ||||
| Pair2: MG_2 (RNase R +) | 9, 68, 40790 | ||||
| Pair2: MG_6 (RNase R-) | 10, 16, 09754 | ||||
| Pair3: MG_3 (RNase R +) | 11, 15, 76344 | ||||
| Pair3: MG_7 (RNase R-) | 11 ، 13 ، التي | ||||
| 3 | إجمالي الحمض الريبي المدخلات | 1 ميكروغرام مقابل 2 ميكروغرام مقابل 4 ميكروغرام | MG ، OC ، SF ، UC | MG: 1 ميكروغرام | 12, 00, 94758 |
| MG: 2 ميكروغرام | 11, 64, 75728 | ||||
| MG: 4 ميكروغرام | 12, 13, التي | ||||
| OC: 1 ميكروغرام | 11, 11, 18120 | ||||
| OC: 2 ميكروغرام | 11, 53, 25492 | ||||
| OC: 4 ميكروغرام | 11, 49, 13266 | ||||
| SF: 1 ميكروغرام | 12, 27, 24142 | ||||
| SF: 2 ميكروغرام | 9, 39, 33288 | ||||
| SF: 4 ميكروغرام | 12, 33, 31474 | ||||
| UC: 1 ميكروغرام | 9, 24, 48120 | ||||
| UC: 2 ميكروغرام | 12, 58, 15354 | ||||
| UC: 4 ميكروغرام | 12, 56, 92534 | ||||
| 4 | أنواع الانسجه | مناطق الدماغ مقابل أنواع الانسجه الأخرى | BC, MG, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 10, 72, 08904 |
| BC_2 | 11, 18, 33362 | ||||
| BC_3 | 9, 61, 25856 | ||||
| BC_4 | 9, 62, 77094 | ||||
| IP_1 | 9, 86, 56506 | ||||
| IP_2 | 11, 35, 95746 | ||||
| IP_3 | 12, 87, 81536 | ||||
| IP_4 | 9, 59, 81446 | ||||
| MG_1 | 10, 76, 09934 | ||||
| MG_2 | 9, 68, 40790 | ||||
| MG_3 | 11, 15, 76344 | ||||
| MG_4 | 10, 05, 39028 | ||||
| OC_1 | 8, 85, 47042 | ||||
| OC_2 | 12, 09, 83142 | ||||
| OC_3 | 10, 26, 55452 | ||||
| OC_4 | 10, 84, 49330 | ||||
| SF_1 | 8, 76, 21824 | ||||
| SF_2 | 14, 50, 57894 | ||||
| SF_3 | 11, 01, 52030 | ||||
| SF_4 | 9, 67, 24472 | ||||
| LN_1 | 15, 02, 94816 | ||||
| LN_2 | 8, 33, 30187 | ||||
| LN_3 | 11, 30, 96032 | ||||
| LN_4 | 10, 78, 38278 | ||||
| LU_1 | 16, 05, 27595 | ||||
| LU_2 | 8, 94, 30799 | ||||
| LU_3 | 9, 14, 51858 | ||||
| LV_1 | 9, 72, 18369 | ||||
| LV_2 | 10, 54, 16880 | ||||
| LV_3 | 8, 86, 53148 | ||||
| LV_4 | 8, 61, 02943 | ||||
| LV_5 | 12, 87, 88483 | ||||
| LV_6 | 11, 87, 76622 | ||||
| PA_1 | 8, 79, 20160 | ||||
| PA_2 | 7, 82, 36741 | ||||
| PA_3 | 10, 21, 24209 | ||||
| PA_4 | 11, 53, 22926 |
الجدول 1: ملخص ظروف العينة والاختبار. ملخص لجميع المعلمات وشروط الاختبار التي تم تقييمها في هذه الدراسة ، بالاضافه إلى إجمالي عدد القراءات المتسلسلة التي تم إنشاؤها لكل عينه. UC = التحكم العالمي ، MG = الجيروسكوبات المتوسطة الصدغية ، OC = القشرة القذالي ، BC = المخيخ ، IP = الفص الجداري السفلي ، SF = الجيروسكوبات الاماميه المتفوقة ، LU = الرئة ، LV = الكبد ، LN = العقدة الليمفاوية ، PA = البنكرياس ، RNase r = rnase r ، RNase R + = المعالجة المسبقة مع rnase r ، R-= لا قبل المعالجة مع RNase r.
| مصدر العينة | كميه المدخلات/العينات المختبرة | النسبة المئوية rRNA |
| Uc | دعامات: 1 ميكروغرام | 5.53 في المائة |
| دعامات: 2 ميكروغرام | 4.11 في المائة | |
| دعامات: 4 ميكروغرام | 4.38 في المائة | |
| دعامات: 5 ميكروغرام | 3.21 في المائة | |
| دعامات: 10 ميكروغرام | 3.74 في المائة | |
| Kapa: 1 ميكروغرام | 5.57 في المائة | |
| Kapa: 2 ميكروغرام | 4.56 في المائة | |
| Kapa: 4 ميكروغرام | 9.67 في المائة | |
| Kapa: 5 ميكروغرام | 12.69 في المائة | |
| Kapa: 10 ميكروغرام | 15.59 في المائة |
الجدول 2: النسب المئوية rRNA في المكتبات Kapa مقابل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وفي هذه الدراسة ، تم اختبار مجموعتين من مجموعات اعداد المكتبات المتاحة تجاريا ، وخيارات ما قبل المعالجة ، وكميات الحمض الريبي للإدخال من أجل تحسين بروتوكول إثراء circRNA لبناء مكتبات تسلسل circRNA. واستنادا إلى تقييمات هذه الدراسة ، فان عددا من الجوانب الرئيسية والخطوات الحاسمة في إنشاء مكتبات تسلسل circRNA واضحة. ويؤكد تقييمنا فائده المعالجة المسبقة RNase R ، كما ينعكس ذلك في زيادة عدد circRNAs المكتشفة. وبشكل عام ، لوحظ وجود تنوع اعلي من circRNAs عند استخدام مجموعه المكتبات الخاصة بشركه "الومينا" مع RNase R قبل المعالجة و 4 ميكروغرام من إدخال RNA. تتوافق هذه النتائج مع النتائج السابقة التي تفيد بان خطوه إثراء RNase R مفيده للكشف عن circRNAs2.
وتشمل الجوانب الرئيسية الاضافيه لبناء مكتبه circRNA كميه الحمض الريبي النيبالي الإجمالي الذي يتوفر للتسلسل ، فضلا عن نوع الانسجه التي استخرجها الحمض الريبي النيبالي من. علي الرغم من انه تم العثور علي إدخال 4 ميكروغرام من إجمالي الحمض الريبي النيبالي لتسفر عن أكبر عدد من circRNAs المكتشفة, الغالبية العظمي من الدراسات RNAseq الاستفادة < = 1 ميكروغرام من مجموع RNA مثل ان الحصول علي كميات اعلي قد يكون تحديا, لا سيما لتحليل العينات البشرية. ولا يزال تحديد الهوية الخاصة بالcircrnas ممكنا بالنسبة لكميات المدخلات الأقل ، ولكن من المهم الإقرار بان خصوصية التحليل قد تتاثر. وتسلط هذه الدراسة الضوء علي العدد الأكبر من السيكرناس التي يتم اكتشافها في المخ البشري مقارنه بالانسجه الأخرى ، كما ذكر سابقا19،20. ولذلك فمن الاهميه بمكان الاعتراف بالتعبير التفاضلي ل circRNAs عبر أنواع مختلفه من الانسجه. وعلاوة علي ذلك ، ستكون البحوث الاضافيه في سياق المرض مهمة لتسليط الضوء علي كيفيه مشاركه circRNAs في العمليات المسببة للامراض.
ويسلط أداء المجموعتين المقررتين لاعداد المكتبات الخاصة بالحمض الريبي النيبالي الضوء أيضا علي انه علي الرغم من ان مجموعات مختلفه متاحه تجاريا قد تظهر أوجه تشابه كبيره ، لا تزال الاختلافات تلاحظ عند تحليل circRNAs. ومن بين النتائج الرئيسية التي توصلت اليها هذه المقارنة انخفاض استنفاد الحمض الريبي وانخفاض عدد الشركات التي تم تحديدها باستخدام نهج واحد. في حين ان أحد الاحتمالات هو ان وفره اعلي من rRNA في عينه قد تتداخل مع إنشاء تسلسل قادره علي جزيئات مكتبه circRNA ، وهذا الاستنتاج يؤكد علي الحاجة إلى تقييم مجموعات مماثله علي ما يبدو ، وخاصه عندما الكواشف هي الملكية.
علي الرغم من ان البيانات المقدمة هنا يوفر رؤى حول وجود ووفره من circRNAs في أنواع مختلفه من الانسجه ، وهذه الدراسة لديها بعض القيود التقنية. أولا ، في حين ان العلاج RNase R يقلل من عدد السكان من RNAs الخطي في عينه ، فانه ليس من المفهوم جيدا إذا كانت هذه الخطوة استنزاف يقدم اي تحيز في الكشف circRNA وما إذا كان قد تستنفد Circrna. وقد أفادت الدراسات السابقة انه في بعض الحالات ، والcircrnas حساسة ل rnase R2،24،25. وثانيا ، من غير الواضح ما إذا كانت زيادة المدخلات الاجماليه RNA فوق 4 ميكروغرام سيؤدي إلى زيادة خطيه في عدد circRNAs المحددة. بما ان سابقا يذكر, يتوفر إجماليه [رنا] غالبا محدوده في بحث دراسات هكذا [لوور] مدخل اعتبرت مبالغ كان هنا. من الملاحظة ، لا يزال يمكن الكشف عن circRNAs عند استخدام مدخلات اقل ولكن من المهم الاعتراف بان المدخلات الأقل مرتبطة بالكشف عن عدد اقل من circRNAs. ثالثا ، البروتوكول الأمثل المقدمة هنا يستخدم RNAs المستخرجة من مجموعه محدده من الانسجه. النظر إلى التوزيع المتغير للتعبير circRNA عبر أنواع مختلفه من الانسجه ، قد تختلف العلاقة بين إجمالي كميات المدخلات RNA وعدد Circrna المحددة عبر الانسجه.
ومع تزايد الاهتمام بفهم الدور البيولوجي لcircrnas ، يجري أيضا وضع استراتيجيات جديده لتحسين التمكين من توصيف وتحديد circRNAs. واحد نهج المعلوماتية الحيوية الجديدة تمكن من تحديد circRNAs التي قد تكون متواضعة عبر أعاده بناء circRNAs بالطول الكامل ، وأيضا تمكن من التقدير الكمي للتعبير عن الاشكال المحددة من isocrna26. يستفيد هذا النهج من الميزات الموصوفة كقراءه التراكب العكسي (RO) التي قد تحدث علي نهايات 3 ' أو 5 ' من جزيئات مكتبه circRNA. سيساهم وضع استراتيجيات جديده للتعرف علي النهج المختبرية وأداات المعلوماتية الحيوية في فهم المجال لوظيفة وتاثير circRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لمعهد البحوث الصحية الشمس راية الدماغ والجسم برنامج التبرع (BBDP) من صن سيتي, ولاية اريزونا لتوفير انسجه المخ البشرية. وقد تم دعم BBDP من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (U24 NS072026 الوطنية الدماغ والانسجه الموارد لمرض باركنسون والاضطرابات ذات الصلة) ، المعهد الوطني للشيخوخة (P30AG19610 اريزونا مرض الزهايمر مركز الاساسيه), ولاية اريزونا قسم الخدمات الصحية (عقد 211002, اريزونا مركز البحوث الزهايمر), ولاية اريزونا لجنه البحوث الطبية الحيوية (عقود 4001, 0011, 05-901 و 1001 إلى اتحاد مرض باركنسون في ولاية اريزونا) ومايكل J. مؤسسه فوكس للبحوث باركنسون27. وقد دعمت هذه الدراسة أيضا من قبل وزاره التعليم الوطني وولاية اريزونا (ADHS منحه # ADHS14-052688). كما نشكر أندريا شميت (بحث بانر) وسينثيا ليهوغا (TGen) للدعم الإداري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al.
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al.
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
