Summary
Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.
Abstract
Circular RNAs (circRNAs) sind eine Klasse von nicht-kodierenden RNAs, die an Funktionen wie Mikro-RNA-Regulierung (miRNA), Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Regulierung der elterlichen Gentranskription beteiligt sind. In der klassischen RNA-Sequenzierung der nächsten Generation (RNA-seq) werden CircRNAs in der Regel als Ergebnis der Poly-A-Auswahl während des Aufbaus von mRNA-Bibliotheken übersehen oder sind in sehr geringer Häufigkeit zu finden und daher schwer zu isolieren und zu erkennen. Hier wurde ein circRNA-Bibliotheksbauprotokoll optimiert, indem Bibliotheksvorbereitungskits, Vorbehandlungsoptionen und verschiedene gesamte RNA-Eingangsmengen verglichen wurden. Getestet wurden zwei handelsübliche Volltranskriptom-Bibliotheksvorbereitungskits mit und ohne RNase R-Vorbehandlung und unter Verwendung variabler Mengen des gesamten RNA-Eingangs (1 bis 4 g). Schließlich, mehrere Gewebetypen; einschließlich Leber, Lunge, Lymphknoten und Bauchspeicheldrüse; sowie mehrere Hirnregionen; einschließlich des Kleinhirns, des minderwertigen parietalen Lappens, des mittleren zeitlichen Gyrus, des okzipitalen Kortex und des überlegenen frontalen Gyrus; wurden verglichen, um die Häufigkeit von ZirkRNA über Gewebetypen hinweg zu bewerten. Die Analyse der generierten RNA-Seq-Daten mit sechs verschiedenen circRNA-Detektionswerkzeugen (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC und CIRCexplorer) ergab, dass ein gestrandetes Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitungskit mit RNase R-Vorbehandlung und 4-g-RNA-Eingang der optimale Methode zur Identifizierung der höchsten relativen Anzahl von circRNAs. Im Einklang mit früheren Befunden wurde die höchste Anreicherung von CircRNAs in Hirngeweben im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.
Introduction
Circular RNAs (CircRNAs) sind endogene, nicht-kodierende RNAs, die aufgrund ihrer allgegenwärtigen Expression im eukaryotischen Transkriptom1,2,3Aufmerksamkeit erlangt haben. Sie werden gebildet, wenn exons zurück zueinander und daher wurden zunächst als spleißende Artefakte4,5. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass CircRNAs Zelltyp, Gewebe und Entwicklungsstadium spezifische Expression3,6 aufweisen und evolutionär konserviert sind2,3. Darüber hinaus sind sie an der Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen7, Mikro-RNA (miRNA) Bindung3,8,9,10, und Regulierung der elterlichen Gentranskription beteiligt11.
Bei der klassischen RNA-Sequenzierung (RNA-seq) können CircRNAs während des Bibliotheksbaus als Folge der Poly-A-Auswahl für mRNAs vollständig verloren gehen oder aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwer zu isolieren sein. Jüngste CircRNA-Charakterisierungsstudien haben jedoch einen Vorbehandlungsschritt mit RNase R integriert, um für circRNAs2,12,13anzureichern. RNase R ist eine Exoribonuklease, die lineare RNAs verdaut und kreisförmige RNA-Strukturen hinterlässt. CircRNA-Anreicherungsprotokolle wurden optimiert, indem Daten aus zwei kommerziell erhältlichen Gesamt-Transkriptom-Bibliotheksbausätzen mit und ohne RNase R-Vorbehandlungsschritt generiert und verglichen wurden und unterschiedliche Mengen an RNA-Eingang (1 bis 4 g) verwendet wurden. Das optimierte Protokoll wurde als nächstes verwendet, um die Häufigkeit von CircRNAs in fünf verschiedenen Hirnregionen (Kleinhirn [BC], minderwertiger parietaler Lappen [IP], mittlerer zeitlicher Gyrus [MG], okzipitaler Kortex [OC] und überlegener frontaler Gyrus [SF]) und vier anderen Gewebetypen (Leber [LV], Lunge [LU], Lymphknoten [LN] und Bauchspeicheldrüse [PA]) zu bewerten. RNA-Seq-Bibliotheken wurden am Ende sequenziert und die Daten wurden mit sechs verschiedenen circRNA-Vorhersagealgorithmen analysiert: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17und CIRCexplorer18. Basierend auf unserer Analyse wurde die höchste Anzahl einzigartiger CircRNAs bei der Verwendung eines gestrandeten gesamten RNA-Bibliotheksvorbereitungskits mit RNase R-Vorbehandlung und 4 g Gesamt-Input-RNA nachgewiesen. Das optimierte Protokoll wird hier beschrieben. Wie bereits berichtet19,20, wurde die höchste Anreicherung von CircRNAs im Gehirn im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet.
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Protocol
Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Leitlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Hirngewebe wurde vom Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program in Sun City, AZ, bezogen. Die Operationen des Brain and Body Donation Program werden vom Western Institutional Review Board (WIRB-Protokoll #20120821) genehmigt. Alle Probanden oder ihre gesetzlichen Vertreter unterzeichneten die informierte Einwilligung. Kommerzielle (nicht-Gehirn) Biospecimen wurden von Proteogenex gekauft.
1. Rnase R Behandlung
HINWEIS: In den folgenden Schritten wird das Reaktionsvolumen auf ein Gesamtvolumen von 50 l eingestellt. Dies ist das minimale Probenvolumen, das im RNA-Bereinigungs- und Konzentrator-Kit verwendet werden soll (siehe Tabelle der Materialien). Zusätzlich ist das hier beschriebene optimierte Protokoll für eine Eingangsmenge von 4 g Gesamt-RNA. Für eine Eingangsmenge von >4 g wird eine längere Inkubationszeit für die RNase R-Behandlung empfohlen.
- Verdünnen Sie die Gesamt-RNA in 39 l RNase-freiem Wasser in einem Mikrozentrifugenrohr auf 4 g und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.
- In einem separaten Rohr die RNase R auf eine Arbeitskonzentration von 2 U/L mit 1x RNase R-Reaktionspuffer verdünnen. Machen Sie nur genug für den sofortigen Gebrauch.
- Pipette 39 l der gesamten RNA und 5 l 10x RNase R Reaktionspuffer in ein 1,5 ml Reaktionsrohr und mischen Sie gut durch Pipettieren (50 l wird das gesamte Reaktionsvolumen sein). Als nächstes fügen Sie 6 l RNase R (2 U/L) hinzu.
- Stellen Sie die Pipette auf das volle Reaktionsvolumen (50 l) ein und mischen Sie sie gut, indem Sie 10-mal nach oben und unten pfeifen.
- Legen Sie das Rohr 10 min in ein 37 °C-Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass das volle Reaktionsvolumen in das Wasserbad eingetaucht ist.
- Legen Sie die Röhre auf Eis und gehen Sie sofort mit RNA-Reinigung & Konzentration (Abschnitt 2) fort.
2. Reinigung der RNA mit einem RNA Cleanup and Concentrator Kit
HINWEIS: Bei Verwendung hochwertiger RNA (RIN>8, DV200>80%) kann die RNase R-Behandlung zu einem Verlust von ca. 60% der RNA führen. Mit einem 4-g-Eingang wird geschätzt, dass nach Abschnitt 1 2–2,5 g behandelte RNA übrig bleiben.
- Vor dem Start den RNA-Waschpuffer vorbereiten, indem Sie 48 ml 100% Ethanol in das Pufferkonzentrat geben und durch Pipettieren gut mischen. Platzieren Sie Reinigungssäulen in Sammelrohre (siehe Materialtabelle) und legen Sie sie in ein Rohrgestell.
HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden Zentrifugationseinstellungen für alle folgenden Schritte: 10.000–16.000 x g. Wenn die Behandlung von DNase I bereits durchgeführt wurde, überspringen Sie die DNase I-Behandlung in diesem Stadium. - Fügen Sie der von RNase R behandelten Probe 2 Volumen von RNA-Bindungspuffer hinzu und mischen Sie sie gut durch Pipettieren (Gesamtvolumen: 150 l).
- Fügen Sie dem mit DER RNA-Bindungspuffer und rNase R behandelten Probenmischung 1 Volumen von 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie sie gut durch Pipettieren (Gesamtvolumen: 300 l).
- Übertragen Sie das gesamte Volumen auf die Säule und zentrieren Sie die Säule für 30 s. Entsorgen Sie den Durchfluss durch.
- Fügen Sie 400 L RNA-Vorbereitungspuffer direkt in die Spalte, zentrifugieren Sie die Säule für 30 s und entsorgen Sie den Durchfluss durch.
- Fügen Sie der Säule 700 l RNA-Waschpuffer direkt hinzu, zentrifugieren Sie die Säule für 30 s und entsorgen Sie den Durchfluss durch.
- Fügen Sie 400 l RNA-Waschpuffer direkt in die Säule, zentrifugieren Sie die Säule für 2 min und übertragen Sie die Säule in ein frisches RNase-freies 1,5 ml-Rohr.
- Fügen Sie 11 L RNase-freies Wasser direkt in die Säule ein, indem Sie die Pipettenspitze direkt über dem Säulenfilter halten und sicherstellen, dass Wasser nur auf dem Säulenfilter landet.
- Inkubieren Sie die Säule für 1 min bei Raumtemperatur und Zentrifuge für 1 min.
- Bevor Sie die Spalte verwerfen, überprüfen Sie, ob der Durchfluss im RNase-freien Rohr durchfließt. Wenn die Elution erfolgreich war, lagern Sie die Probe bei -80 °C oder fahren Sie sofort mit der Bibliotheksvorbereitung fort. Für den Bibliotheksbau wird das endgültige Gesamtelutionsvolumen von ca. 10 l verwendet.
HINWEIS: Haltepunkt: Lassen Sie die RNA bis zu 7 Tage bei -80 °C liegen, bevor Sie mit der Bibliotheksvorbereitung fortfahren.
3. circRNA Library Prep
HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien für Kit, das die meisten reagenzien enthält, die in diesem Abschnitt verwendet werden.
- rRNA-Erschöpfung und Fragmentierung
- Übertragen Sie 10 l gereinigte RNA von Schritt 2,10 auf einen sauberen Brunnen in einer neuen 96-well 0,3 ml PCR-Platte. Fügen Sie dem Brunnen 5 l rRNA-Bindungspuffer hinzu, gefolgt von 5 l rRNA Removal Mix. Sanft Pipette nach oben und unten 10 Mal zu mischen.
- Dichtungsplatte und inkubieren Sie für 5 min bei 68 °C auf einem vorprogrammierten, vorgeheizten Thermocyclerblock. Nach Abschluss der 5 min Inkubation Platte auf die Bank legen und bei Raumtemperatur für 1 min inkubieren.
- Entfernen Sie die Dichtung von der Platte. Fügen Sie 35 l wirbelnde Raumtemperatur rRNA Entfernungsperlen zu Probe. Stellen Sie die Pipette auf 45 l und die Pipette 10–20x nach oben und unten ein, um sie gründlich zu mischen. Inkubationsplatte für 1 min bei Raumtemperatur.
- Platte auf einen Magnetischen Ständer übertragen und auf dem Ständer für 1 min oder bis die Lösung klar ist, inkubieren. Übertragen Sie den gesamten Überstand (ca. 45 l) auf einen neuen Brunnen auf derselben Platte oder eine neue Platte (je nachdem, mit wie vielen Proben Sie arbeiten).
- Wirbel die RNA-Reinigungsperlen (siehe Tabelle der Materialien) bis gut dispergiert, und fügen Sie 99 L Perlen zu jeder Probe. Pipette nach oben und unten 10x zu mischen. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 min.
- Übertragen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer und inkubieren Sie zusätzlich 5 min oder bis die Lösung klar ist. Entfernen und entsorgen Sie den gesamten Überstand aus dem Brunnen.
- Mit der Platte noch auf dem magnetischen Ständer, fügen Sie 200 l frisch zubereitete 80% EtOH in den Brunnen, ohne die Perlen zu stören. 30 s inkubieren, dann Ethanol entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie dies für insgesamt 2 Wähbe.
- Fügen Sie jedem Bohrwert 11 L Elution Buffer und pipette nach oben und unten 10 Mal zum Mischen hinzu. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren und dann auf den magnetischen Ständer übertragen, bis sich die Lösung abklärt (1–5 min).
- Übertragen Sie 8,5 l des Überstandes vom Brunnen auf einen neuen Brunnen auf der gleichen Platte oder auf eine neue Platte. Fügen Sie jeder bohrenhaltigen Probe 8,5 l elute, Primer, Fragment High-Mischung hinzu. Pipette auf und ab 10 Mal gründlich mischen.
- Dichtungsplatte und inkubieren für 8 min bei 94 °C auf einem vorprogrammierten, vorgeheizten Thermocyclerblock. Entfernen Sie vom Thermocycler, wenn er 4 °C erreicht, und Zentrifuge kurz.
HINWEIS: Fahren Sie sofort mit dem Synthesize First Strand cDNA-Protokoll fort.
- Synthesize-cDNA
- Für jede zu erstellende Probe 9 L First Strand Synthesis Mix mit 1 L Reverse-Transkriptase mischen (siehe Materialtabelle). Fügen Sie der Probe 8 l der Mischung hinzu. Pipette nach oben und unten 6 mal zu mischen.
- Dichtungsplatte und Inkubation auf einem vorprogrammierten, vorgeheizten Thermocyclerblock mit folgenden Parametern: 25 °C für 10 min, 42 °C für 15 min, 70 °C für 15 min, 4 °C halten. Fahren Sie sofort zur zweiten Strangsynthese fort.
- Fügen Sie jeder Probe 5 L Resuspension-Puffer hinzu, gefolgt von 20 L des Master-Mixes "Second Strand Marking". Pipette das gesamte Volumen nach oben und unten 6 mal.
- Dichtungsplatte und Inkubation auf einem vorprogrammierten, vorgewärmten Thermocycler-Block auf 16 °C für 1 h eingestellt. Nach der Inkubation die Platte aus dem Thermocycler entfernen und auf Raumtemperatur ausdugieren lassen.
- Vortex PCR Reinigungsperlen (siehe Tabelle der Materialien) und fügen Sie 90 L Perlen zu jedem Brunnen der Probe. Pipette auf und ab 10 Mal gründlich mischen. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
- Die Perlen-/Probenmischung auf den magnetischen Stand übertragen und 5 min oder bis flüssigkeitsfrei wird, inkubieren. Entfernen und verwerfen Sie Überstand.
- Fügen Sie jeder Probe 200 L von 80 % EtOH hinzu. Inkubieren Sie Proben auf dem magnetischen Ständer bei Raumtemperatur für 30 s. Verwerfen Überstand. Wiederholen Sie 1x.
- Lassen Sie Perlen bei Raumtemperatur für 6 min trocknen, und dann aus dem magnetischen Ständer entfernen.
- Resuspend Perlen in 19,5 l Resuspension Puffer. Pipette auf und ab 10 Mal gründlich mischen. Bei Raumtemperatur 2 min inkubieren, dann auf den magnetischen Stand übertragen und zusätzlich 1 min oder bis die Flüssigkeit abklarheitt, inkubieren.
- Übertragen Sie 17,5 l Überstand auf neue Gut/neue Platte.
HINWEIS: Wenn die Proben nicht sofort fortgesetzt werden, können sie bis zu 7 Tage bei -20 °C gelagert werden.
- Für jede zu erstellende Probe 9 L First Strand Synthesis Mix mit 1 L Reverse-Transkriptase mischen (siehe Materialtabelle). Fügen Sie der Probe 8 l der Mischung hinzu. Pipette nach oben und unten 6 mal zu mischen.
- Bibliotheksvorbereitung
- Fügen Sie jedem Brunnen, der über einen Überstand enthält, 12,5 l A-Tailing Mix hinzu. Pipette das gesamte Volumen nach oben und unten 10 mal zu mischen.
- Inkubieren Sie die Reaktion auf einem vorprogrammierten, vorgewärmten Thermocycler-Block, der auf 37 °C eingestellt ist, mit den folgenden Parametern: 37 °C für 30 min, 70 °C für 5 min, 4 °C halten. Wenn die Proben 4 °C erreichen, fahren Sie sofort mit adapterligation fort.
- Zu jeder Probe fügen Sie 2,5 l Resuspension-Puffer, 2,5 l eines einzigartigen RNA-Adapters und 2,5 l Ligation Mix hinzu. Pipette nach oben und unten 10x zu mischen.
- Inkubieren Sie Proben auf einem vorprogrammierten, vorgewärmten Thermocyclerblock bei 30 °C für 10 min.
- Fügen Sie jeder Probe und Pipette 5 L Stop Ligation Puffer nach oben und unten hinzu, um sie zu mischen.
- Fügen Sie 42 L gemischte PCR-Reinigungsperlen zu jeder Probe hinzu und mischen Sie sie gründlich. Befolgen Sie die Schritte 3.2.6 bis 3.2.10, ändern Sie jedoch das Resuspensionsvolumen auf 52 l und das Endelutionsvolumen auf 50 l.
- Wiederholen Sie das PCR-Reinigungs-Perlenprotokoll mit der 50-L-Elution ab Schritt 3.3.6 erneut, ändern Sie jedoch das Resuspensionsvolumen auf 22 l und das Endelutionsvolumen auf 20 l.
HINWEIS: Wenn die Proben nicht sofort fortgesetzt werden, können sie bis zu 7 Tage bei -20 °C gelagert werden. - Fügen Sie jeweils 5 L PCR Primer Cocktail und 25 l PCR Master Mix zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 10 mal. Inkubieren Sie die Reaktion auf einem vorprogrammierten, vorgewärmten Thermocyclerblock unter Verwendung der folgenden Parameter: 98 °C für 30 s; dann 8 Zyklen von 98 °C für 10 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; dann 72 °C für 5 min, dann 4 °C halten.
HINWEIS: Die Optimierung der Gesamtzahl der PCR-Zyklen kann erforderlich sein, um ausreichende Mengen an Bibliothek für die Sequenzierung zu generieren. - Folgen Sie dem Protokoll zur PCR-Perlenreinigung (Schritte 3.2.4 bis 3.2.9), außer fügen Sie 50 L gut gemischte PCR-Reinigungsperlen hinzu und ändern Sie das Resuspensionsvolumen auf 32,5 l bei einem endendgültigen Elutionsvolumen von 30 l.
HINWEIS: Die Proben sollten bei -20 °C gelagert werden.
- Quantifizierung und Qualitätskontrolle mit einem Nukleinsäureanalysator
- Bänder und Reagenzien bei Raumtemperatur 30 min ausdünnen lassen.
- Mischen Sie 2 L Bibliothek mit 2 L HS D1000 Puffer, und fügen Sie zu einer kompatiblen Well-Platte.
- Dicht fest mit kompatibler Foliendichtung und Wirbel für 1 min bei 2.000 Umdrehungen/min versiegeln.
- Drehen Sie die Anzeige und laden Sie die Platte auf den Analysator, nachdem Software-Eingabeaufforderungen angezeigt werden.
HINWEIS: Bibliotheken sollten etwa 260 bp groß sein.
4. Datenanalyse-Workflow
- Sequenz-RNA-seq-Bibliotheken (siehe Tabelle der Materialien), um 82 bp paired-end-Lesevorgänge zu generieren. Konvertieren Sie unformatierte Sequenzierungsdaten in Form von Basecall-Dateien (.bcl) in FASTQs mit dem Tool bcl2fastq (v0.2.19).
- Erkennen Sie circRNAs.
HINWEIS: Basierend auf zuvor berichteten Beweisen, dass ein Ensemble-CircRNA-Erkennungsansatz besser funktioniert als mit einem einzigen Detektionstool21,22, empfehlen wir die Verwendung mehrerer Werkzeuge für die circRNA-Erkennung. Hier wurden circRNAs mit sechs vorhandenen circRNA-Vorhersagealgorithmen identifiziert: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE und DCC, wobei die empfohlenen Parametereinstellungen für jeden Algorithmus angewendet wurden.- Laden Sie jeden circRNA-Erkennungsalgorithmus auf einem Linux-Hochleistungs-Computing-Cluster herunter und installieren Sie ihn unter Verwendung der von den Entwicklern bereitgestellten Anweisungen.
- Richten Sie DIE FASTQs von RNA-seq an dem Referenzgenom (GRCh37) aus, wobei der für jedes Werkzeug empfohlene Aligner verwendet wird.
- Führen Sie nach der Ausrichtung circRNA-Erkennungsalgorithmen aus, indem Sie die jeweils empfohlenen Parametereinstellungen anwenden.
- Jedes Tool gibt eine mehrspaltige Ergebnisdatei mit der Liste der erkannten circRNAs aus, extrahiert die circRNA-Koordinaten und die Anzahl der unterstützenden Lesevorgänge daraus, um die Anzahl der in jeder Probe/Testbedingung erkannten Kandidaten zu quantifizieren.
- Konvertieren Sie die von CIRI, Mapsplice und DCC ausgegebenen circRNA-Koordinaten in 0-basierte Koordinaten, um mit den anderen drei Algorithmen konsistent zu sein.
- Wählen Sie circRNAs mit zwei oder mehr unterstützenden Lese- oder Nachflussanalysen und -vergleichen aus. Tabelle 1 fasst alle in unserer Studie ausgewerteten Parameter zusammen mit der Gesamtzahl der für jede Stichprobe generierten Sequenzierungslesevorgänge zusammen.
- Zählen Sie für jede Beispiel-/Testbedingung die Anzahl der erkannten circRNAs, die normalisiert wurden, auf die Anzahl der zugeordneten Lesevorgänge, die für diese Bibliothek generiert wurden, pro Million. Fassen Sie die Ergebnisse über die verschiedenen Werkzeuge/Beispiele in Box-Plots zusammen, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben.
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Representative Results
Die daten, die mit einer kommerziell erhältlichen Universal Control RNA (UC) und mit zwei Bibliotheksvorbereitungskits generiert wurden, die beide einen Ribo-Erschöpfungsschritt in ihren Protokollen enthalten, wurden zuerst ausgewertet. Mit Hilfe eines analytischen Workflows (Datenanalyse-Workflow, Abschnitt 4) wurde insgesamt eine höhere Anzahl von circRNAs in den TruSeq-Datasets im Vergleich zu den Kapa-Datasets erkannt (Abbildung 1). Obwohl die ribosomalen RNA-Prozentsätze (rRNA) in Datensätzen beider Kits für niedrigere Eingangsmengen (1, 2 ug) unter 5 % lagen, hatten Kapa-Datensätze einen höheren rRNA-Gehalt für 4, 5 und 10 ug-Eingänge (Tabelle 2). Daher wurden basierend auf der Anzahl der nachgewiesenen CircRNAs und der rRNA-Erschöpfungseffizienz weitere Experimente mit dem TruSeq-Kit durchgeführt.
Als nächstes wurde die Bedeutung der RNase R-Vorbehandlung durch einen Vergleich der Daten getestet, die aus rNase R vorbehandelten und nicht vorbehandelten Bibliotheken generiert wurden. Zu diesem Zweck wurde die gesamte RNA aus dem MG gesunder älterer Menschen extrahiert und Sequenzierungsdaten aus Bibliotheken mit (N = 3) und ohne (N = 3) Vorbehandlung mit RNase R23 verglichen. Eine höhere Anzahl von circRNAs wurde in den vorbehandelten Bibliotheken konsistent identifiziert als in den nicht vorbehandelten Bibliotheken (Abbildung 2). Dies wird erwartet, da die Vorbehandlung lineare RNAs entfernt und damit für CircRNA-Arten anreichert.
Drittens wurde die Menge an Input-RNA getestet, die für den Nachweis einer höheren Vielfalt von CircRNAs optimal wäre. Bibliotheken wurden mit 1, 2 und 4 g Gesamt-Input-RNA erstellt, die aus MG-, OC- und SF-Gehirnregionen sowie UC-RNA extrahiert wurde. Vergleicht man die Häufigkeit der von jeder Bibliothek nachgewiesenen CircRNAs, so wurde die höchste Vielfalt an CircRNA-Arten beobachtet, wenn man 4-g-Eingangs-RNA im Vergleich zu 2 und 1 g(Abbildung 3) verwendet, was sich in der Anzahl der identifizierten eindeutigen CircRNAs widerspiegelt. Eine Einschränkung ist, dass zwar verschiedene Inkubationszeiten während der RNase R-Behandlung nicht getestet wurden, ein Trend, bei dem eine zunehmende Anzahl von CircRNAs über die gesamten RNA-Eingänge von 1 bis 4 g hinweg nachgewiesen wurde, bei der Steuerung aller anderen Parameter beobachtet wurde.
Dieses optimierte Protokoll wurde dann über mehrere Gewebetypen angewendet, um die Häufigkeit von ZirkRNA zu vergleichen. Fünf Hirnregionen, darunter BC, MG, OC, IP und SF, von vier gesunden älteren Menschen, wurden getestet, zusammen mit vier anderen Gewebetypen, einschließlich LV, LU, LN und PA, von sechs gesunden Spendern. Insgesamt wurde eine höhere Häufigkeit von CircRNAs im Gehirn im Vergleich zu anderen Gewebetypen beobachtet (Abbildung 4), wie zuvor berichtet19,20.
Abbildung 1: CircRNA-Erkennung mit TruSeq vs. Kapa Total RNA Kits. Die Sequenzierungsdaten wurden für UC-RNA mit zwei separaten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitungskits generiert, die jeweils mit einer Vorbehandlung von 1, 2, 4, 5 und 10 g Input-RNA und Ribonuklease R (RNase R) ausgestattet sind. Die Anzahl der von den Werkzeugen in jeder Stichprobe erkannten CircRNAs wurde auf die Anzahl der zugeordneten Lesevorgänge pro Million (Y-Achse) normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: CircRNA-Detektion mit und ohne RNase R-Vorbehandlung. Sequenzierungsdaten, die mit dem TruSeq-Kit generiert wurden, wurden verwendet, um die Auswirkungen der RNase R-Vorbehandlung zu vergleichen. FÜR diese Analyse wurde RNA aus dem mittleren zeitlichen Gyrus (MG) gesunder älterer Kontrollen extrahiert. Die normalisierte Anzahl der erkannten CircRNAs (Y-Achse) wurde ähnlich wie in Abbildung 1berechnet. RNase R+ = vorbehandelt mit RNase R, RNase R- = nicht vorbehandelt mit RNase R. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: CircRNA-Detektion mit unterschiedlicher Menge an Eingangs-RNA. Anhand von RNA, die aus MG, okzipitalem Kortex (OC) und überlegenem frontalem Gyrus (SF) extrahiert wurde, sowie UC-RNA wurde die Anzahl der eindeutigen CircRNAs verglichen, die bei verwendung von 1, 2 und 4 g Eingangs-RNA nachgewiesen wurden, deren Bibliothek jeweils mit dem TruSeq-Kit und der RNase-R-Vorbehandlung erstellt wurde. Die normalisierte Anzahl der erkannten CircRNAs (Y-Achse) wurde ähnlich wie in Abbildung 1berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: CircRNA-Detektion im Gehirn im Vergleich zu anderen Gewebetypen. CircRNA angereicherte Datensätze mit RNA, die aus verschiedenen Hirnregionen extrahiert wurden, einschließlich Kleinhirn (BC), minderwertiger parietaler Lappen (IP), MG, OC und SF, sowie vier weitere Gewebetypen wie Leber (LV), Lunge (LU), Lymphknoten (LN) und Bauchspeicheldrüse (PA) wurden generiert. Die CircRNA-Anreicherung erfolgte mit dem Illumina TruSeq Kit mit RNase R-Vorbehandlung und 4 g Gesamt-Eingangs-RNA. Box-Plots stellen die Anzahl der circRNAs dar, die von mindestens drei der sechs Werkzeuge in den Proben aus jeder Hirnregion/Gewebeart erkannt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Test # | Parameter ausgewertet | Testbedingungen | Beispielquelle | Geprüfte Eingangsmengen/-bedingungen/Proben | Gesamtanzahl der Sequenzierungslesevorgänge |
| 1 | Bibliotheksvorbereitungskit | Illumina TruSeq Gestrandete Gesamt-RNA im Vergleich zu den Roche Kapa Total RNA-Kits | Uc | TruSeq: 1 g | 8,91,46,128 |
| TruSeq: 2 g | 7,93,90,202 | ||||
| TruSeq: 4 g | 6,66,12,238 | ||||
| TruSeq: 5 g | 7,88,56,902 | ||||
| TruSeq: 10 g | 6,61,06,874 | ||||
| Kapa: 1 g | 8,83,95,496 | ||||
| Kapa: 2 g | 10,66,59,272 | ||||
| Kapa: 4 g | 10,62,34,954 | ||||
| Kapa: 5 g | 7,47,75,914 | ||||
| Kapa: 10 g | 11,00,68,504 | ||||
| 2 | Vorbehandlung | RNase R vorbehandelt vs. nicht vorbehandelt | Mg | Paar1: MG_1 (RNase R+) | 10,76,09,934 |
| Paar1: MG_5 (RNase R-) | 9,62,15,516 | ||||
| Paar2: MG_2 (RNase R+) | 9,68,40,790 | ||||
| Paar2: MG_6 (RNase R-) | 10,16,09,754 | ||||
| Paar3: MG_3 (RNase R+) | 11,15,76,344 | ||||
| Paar3: MG_7 (RNase R-) | 11,13,14,114 | ||||
| 3 | Gesamter RNA-Eingang | 1 g vs. 2 g vs. 4 g | MG, OC, SF, UC | MG: 1 g | 12,00,94,758 |
| MG: 2 g | 11,64,75,728 | ||||
| MG: 4 g | 12,13,15,232 | ||||
| OC: 1 g | 11,11,18,120 | ||||
| OC: 2 g | 11,53,25,492 | ||||
| OC: 4 g | 11,49,13,266 | ||||
| SF: 1 g | 12,27,24,142 | ||||
| SF: 2 g | 9,39,33,288 | ||||
| SF: 4 g | 12,33,31,474 | ||||
| UC: 1 g | 9,24,48,120 | ||||
| UC: 2 g | 12,58,15,354 | ||||
| UC: 4 g | 12,56,92,534 | ||||
| 4 | Gewebetypen | Hirnregionen im Vergleich zu anderen Gewebetypen | BC, MG, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 10,72,08,904 |
| BC_2 | 11,18,33,362 | ||||
| BC_3 | 9,61,25,856 | ||||
| BC_4 | 9,62,77,094 | ||||
| IP_1 | 9,86,56,506 | ||||
| IP_2 | 11,35,95,746 | ||||
| IP_3 | 12,87,81,536 | ||||
| IP_4 | 9,59,81,446 | ||||
| MG_1 | 10,76,09,934 | ||||
| MG_2 | 9,68,40,790 | ||||
| MG_3 | 11,15,76,344 | ||||
| MG_4 | 10,05,39,028 | ||||
| OC_1 | 8,85,47,042 | ||||
| OC_2 | 12,09,83,142 | ||||
| OC_3 | 10,26,55,452 | ||||
| OC_4 | 10,84,49,330 | ||||
| SF_1 | 8,76,21,824 | ||||
| SF_2 | 14,50,57,894 | ||||
| SF_3 | 11,01,52,030 | ||||
| SF_4 | 9,67,24,472 | ||||
| LN_1 | 15,02,94,816 | ||||
| LN_2 | 8,33,30,187 | ||||
| LN_3 | 11,30,96,032 | ||||
| LN_4 | 10,78,38,278 | ||||
| LU_1 | 16,05,27,595 | ||||
| LU_2 | 8,94,30,799 | ||||
| LU_3 | 9,14,51,858 | ||||
| LV_1 | 9,72,18,369 | ||||
| LV_2 | 10,54,16,880 | ||||
| LV_3 | 8,86,53,148 | ||||
| LV_4 | 8,61,02,943 | ||||
| LV_5 | 12,87,88,483 | ||||
| LV_6 | 11,87,76,622 | ||||
| PA_1 | 8,79,20,160 | ||||
| PA_2 | 7,82,36,741 | ||||
| PA_3 | 10,21,24,209 | ||||
| PA_4 | 11,53,22,926 |
Tabelle 1: Zusammenfassung der Proben- und Testbedingungen. Zusammenfassung aller in dieser Studie ausgewerteten Parameter und Testbedingungen sowie der Gesamtzahl der für jede Stichprobe generierten Sequenzierungslesevorgänge. UC = universelle Kontrolle, MG = mittlerer zeitlicher Gyrus, OC = okzipitaler Kortex, BC = Kleinhirn, IP = minderwertiger parietaler Lappen, SF = überlegener frontaler Gyrus, LU = Lunge, LV = Leber, LN = Lymphknoten, PA = Bauchspeicheldrüse, RNase R = Ribonuklease R, RNase R+ = vorbehandelt mit RNase R, RNase R- = nicht vorbehandelt.
| Beispielquelle | Geprüfte Eingangsmengen/Proben | Prozent rRNA |
| Uc | TruSeq: 1 g | 5.53% |
| TruSeq: 2 g | 4.11% | |
| TruSeq: 4 g | 4.38% | |
| TruSeq: 5 g | 3.21% | |
| TruSeq: 10 g | 3.74% | |
| Kapa: 1 g | 5.57% | |
| Kapa: 2 g | 4.56% | |
| Kapa: 4 g | 9.67% | |
| Kapa: 5 g | 12.69% | |
| Kapa: 10 g | 15.59% |
Tabelle 2: rRNA-Prozentsätze in TruSeq-Bibliotheken im Vergleich zu Kapa-Bibliotheken.
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Discussion
In dieser Studie wurden zwei kommerziell erhältliche Bibliotheksvorbereitungskits, Vorbehandlungsoptionen und Eingangs-RNA-Mengen getestet, um ein circRNA-Anreicherungsprotokoll für den Bau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken zu optimieren. Basierend auf den Bewertungen dieser Studie sind eine Reihe wichtiger Aspekte und kritische Schritte bei der Erstellung von circRNA-Sequenzierungsbibliotheken offensichtlich. Unsere Bewertung bestätigt den Nutzen der RNase R-Vorbehandlung, was sich in der erhöhten Anzahl der nachgewiesenen CircRNAs widerspiegelt. Insgesamt wurde eine höhere Vielfalt an CircRNAs bei Verwendung des Illumina TruSeq Bibliothekskits mit RNase R-Vorbehandlung und 4 g Eingangs-RNA beobachtet. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Erkenntnissen überein, dass der RNase R-Anreicherungsschritt für den Nachweis von circRNAs2von Vorteil ist.
Weitere Schlüsselaspekte des CircRNA-Bibliotheksaufbaus sind die Menge an Gesamt-RNA, die für die Sequenzierung zur Verfügung steht, sowie die Art des Gewebes, aus dem die RNA extrahiert wurde. Obwohl ein 4-g-Eingang der gesamten RNA die höchste Anzahl von nachgewiesenen CircRNAs lieferte, nutzt die Mehrheit der RNAseq-Studien <=1 g Gesamt-RNA, so dass die Gewinnung höherer Mengen eine Herausforderung sein kann, insbesondere für die Analyse menschlicher Proben. Die Identifizierung von circRNAs ist für niedrigere Eingangsbeträge weiterhin möglich, es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass die Spezifität der Analyse beeinträchtigt werden kann. Diese Studie hebt ferner die höhere Anzahl von CircRNAs hervor, die im menschlichen Gehirn im Vergleich zu anderen Geweben nachgewiesen werden, wie zuvor berichtet19,20. Es ist daher wichtig, die differenzielle Expression von CircRNAs über verschiedene Gewebetypen hinweg anzuerkennen. Darüber hinaus wird zusätzliche Forschung im Zusammenhang mit Krankheiten wichtig sein, um Zufundung zu bringen, wie CircRNAs in pathogene Prozesse involviert sein können.
Die Leistung der beiden bewerteten RNA-Bibliotheksvorbereitungskits zeigt auch, dass zwar unterschiedliche kommerziell erhältliche Kits signifikante Ähnlichkeiten aufweisen können, unterschiede jedoch bei der Analyse von circRNAs beobachtet werden. Zwei wichtige Ergebnisse dieses Vergleichs sind eine verringerte rRNA-Erschöpfung und eine geringere Anzahl von circRNAs, die mit einem Ansatz identifiziert wurden. Während eine Möglichkeit ist, dass eine höhere Fülle von rRNA in einer Probe bei der Schaffung sequenzfähiger circRNA-Bibliotheksmoleküle stören kann, betont dieser Befund die Notwendigkeit, scheinbar ähnliche Kits zu bewerten, insbesondere wenn Reagenzien proprietär sind.
Obwohl die hier vorgestellten Daten Einblicke in die Existenz und Fülle von CircRNAs in verschiedenen Gewebetypen liefern, weist diese Studie einige technische Einschränkungen auf. Erstens, während RNase R Behandlung reduziert die Population von linearen RNAs in einer Probe, es ist nicht gut verstanden, ob dieser Erschöpfungsschritt führt irgendwelche Verzerrungen in der circRNA-Erkennung und ob es circRNAs abbauen kann. Frühere Studien haben berichtet, dass circRNAs in einigen Fällen empfindlich auf RNase R2,24,25sind. Zweitens ist unklar, ob eine Erhöhung des gesamten RNA-Eingangs über 4 g zu einer linearen Erhöhung der Anzahl der identifizierten CircRNAs führen wird. Wie bereits erwähnt, ist die verfügbare Gesamt-RNA in Forschungsstudien oft begrenzt, so dass hier geringere Inputmengen berücksichtigt wurden. Bemerkenswert ist, dass circRNAs immer noch erkannt werden können, wenn niedrigere Eingänge verwendet werden, aber es ist wichtig anzuerkennen, dass niedrigere Eingänge mit der Detektion einer geringeren Anzahl von circRNAs verbunden sind. Drittens nutzt das hier vorgestellte optimierte Protokoll RNAs, die aus einem bestimmten Satz von Geweben extrahiert werden. Angesichts der variablen Verteilung der ZirkRNA-Expression auf verschiedene Gewebetypen kann die Assoziation zwischen den gesamten RNA-Eingangsmengen und der Anzahl der identifizierten CircRNAs zwischen Geweben unterschiedlich sein.
Mit zunehmendem Interesse am Verständnis der biologischen Rolle von circRNAs werden auch neue Strategien entwickelt, um eine bessere Charakterisierung und Identifizierung von circRNAs zu ermöglichen. Ein neuer bioinformatischer Ansatz ermöglicht die Identifizierung von CircRNAs, die durch die Rekonstruktion von ZirkNAs in voller Länge niedrig ausgedrückt werden können, und ermöglicht auch die Quantifizierung der Expression spezifischer CircRNA-Isoformen26. Dieser Ansatz nutzt Merkmale, die als Reverse Overlap (RO)-Lesevorgänge beschrieben werden und an den 3' oder 5' Enden von CircRNA-Bibliotheksmolekülen auftreten können. Die Entwicklung neuer Strategien zur Identifizierung von circRNAs, die sowohl Laboransätze als auch Bioinformatik-Tools umfassen, wird zum Verständnis des Feldes für die Funktion und die Auswirkungen von circRNAs beitragen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken dem Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) in Sun City, Arizona, für die Bereitstellung von menschlichem Hirngewebe. Das BBDP wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson es Disease and Related Disorders), dem National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer es Disease Core Center), dem Arizona Department of Health Services (Vertrag 211002, Arizona Alzheimer es Research Center), die Arizona Biomedical Research Commission (Verträge 4001, 0011, 05-901 und 1001 an das Arizona Parkinson es Disease Consortium) und das Michael J. Fox Foundation for Parkinson es Research27. Diese Studie wurde auch vom DHS und dem Bundesstaat Arizona unterstützt (ADHS-Stipendium ADHS14-052688). Wir danken auch Andrea Schmitt (Banner Research) und Cynthia Lechuga (TGen) für die administrative Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
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