Summary
Circulaire Rna's (Circrna's) zijn niet-Codeer Rna's die mogelijk rollen hebben in transcriptionele regulatie en die interacties tussen eiwitten bemiddel- Na beoordeling van verschillende parameters voor de bouw van circRNA sequencing Bibliotheken, een protocol werd gecompileerd met behulp van gestrande Total RNA Library voorbereiding met RNase R pre-behandeling en wordt hier gepresenteerd.
Abstract
Circulaire Rna's (Circrna's) zijn een klasse van niet-Codeer Rna's die betrokken zijn bij functies zoals micro-RNA (miRNA)-regulering, bemiddeling van eiwit-eiwit interacties en regulering van de transcriptie van ouder genen. In de klassieke volgende generatie RNA sequencing (RNA-SEQ), Circrna's worden meestal over het hoofd gezien als gevolg van poly-een selectie tijdens de bouw van mRNA Bibliotheken, of zijn te vinden op zeer lage overvloed, en zijn daarom moeilijk te isoleren en op te sporen. Hier werd een circRNA Library Construction protocol geoptimaliseerd door het vergelijken van bibliotheek voorbereidings kits, pre-behandelingsopties en verschillende totaal RNA input bedragen. Twee in de handel verkrijgbare complete transcriptome bibliotheek voorbereidings kits, met en zonder RNase R voor behandeling, en het gebruik van variabele hoeveelheden RNA input (1 tot 4 μg), werden getest. Ten slotte, meerdere weefsel typen; waaronder lever, longen, lymfeklieren en pancreas; naast meerdere hersengebieden; met inbegrip van de cerebellum, inferieure Pariëtale kwab, middelste temporele gyrus, occipitale cortex, en superieure frontale gyrus; werden vergeleken om de overvloed van circRNA over weefsel typen te evalueren. Analyse van de gegenereerde RNA-SEQ-gegevens met behulp van zes verschillende circRNA-detectietools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC en CIRCexplorer) onthulde dat een gestrande Total RNA Library-Voorbereidingspakket met RNase R voor behandeling en 4 μg RNA-input de optimale methode voor het identificeren van het hoogste relatieve aantal Circrna's. In overeenstemming met eerdere bevindingen werd de hoogste verrijking van circRNAs waargenomen in hersenweefsels in vergelijking met andere weefsel typen.
Introduction
Circulaire rna's (circrna's) zijn endogene, niet-Codeer rna's die aandacht hebben gekregen gezien hun pervasieve expressie in de eukaryote transcriptome1,2,3. Ze worden gevormd wanneer exonen terug-Splice aan elkaar en dus werden aanvankelijk beschouwd als splicing artefacten4,5. Recent onderzoek heeft echter aangetoond dat circrnas celtype, weefsel en ontwikkelingsfase specifieke expressie3,6 vertoont en evolutionair wordt bewaard op2,3. Bovendien zijn ze betrokken bij de bemiddeling van eiwit-eiwit interacties7, micro-RNA (Mirna) binding3,8,9,10, en regulering van ouderlijke genen transcriptie11.
In de klassieke RNA-sequencing (RNA-SEQ), kan circRNAs volledig verloren gaan tijdens de bibliotheek constructie als gevolg van poly-een selectie voor Mrna's of kan het moeilijk zijn om te isoleren gezien hun geringe overvloed. Recente circrna-karakterisering studies hebben echter een voorbehandelings stap opgenomen met behulp van RNase R om te verrijken voor circrnas2,12,13. RNase R is een exoribonuclease die lineaire Rna's verteerd, waardoor circulaire RNA-structuren achterblijven. CircRNA verrijking protocollen werden geoptimaliseerd door het genereren en vergelijken van gegevens van twee commercieel beschikbare hele transcriptome bibliotheek bouwkits, met en zonder een RNase R voor behandeling stap, en het gebruik van verschillende hoeveelheden totaal RNA input (1 tot 4 μg). Het geoptimaliseerde protocol werd vervolgens gebruikt om de overvloed aan Circrna's te evalueren in vijf verschillende hersengebieden (cerebellum [BC], inferieure Pariëtale kwab [IP], middelste temporele gyrus [MG], occipitale cortex [OC] en superieure frontale gyrus [SF]) en vier andere weefsel typen (lever [LV], Long [LU], lymfeklier [LN] en alvleesklier [PA]). RNA-SEQ-bibliotheken werden gekoppeld aan de eind geordend en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van zes verschillende circrna Voorspellings algoritmen: find_circ3, ciri14, mapsplice15, Knife16, DCC17en circexplorer18. Op basis van onze analyse werd het hoogste aantal unieke Circrna's gedetecteerd bij het gebruik van een gestrande totale RNA Library Preparation Kit met RNase R voor behandeling en 4 μg totaal input RNA. Het geoptimaliseerde protocol wordt hier beschreven. Zoals eerder gemeld19,20, de hoogste verrijking van circrnas werd waargenomen in de hersenen in vergelijking met andere weefsel soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het welzijn van de mens. Hersenen weefsels werden verkregen uit de banner Sun Health Research Institute hersenen en lichaam donatieprogramma in Sun City, AZ. De operaties van het brein-en lichaams donatieprogramma zijn goedgekeurd door de Western Institutional Review Board (WIRB protocol #20120821). Alle onderwerpen of hun wettelijke vertegenwoordigers ondertekenden de geïnformeerde toestemming. Commerciële (niet-hersen) biospecimens werden aangekocht bij Proteogenex.
1. behandeling met RNase R
Opmerking: In de volgende stappen wordt het reactievolume ingesteld op een totaal volume van 50 μL. Dit is het minimale monstervolume dat moet worden gebruikt in de RNA Cleanup & concentratorkit (Zie tabel met materialen). Bovendien is het hier beschreven geoptimaliseerde protocol voor een ingangs bedrag van 4 μg totaal RNA. Een langere incubatietijd voor de behandeling met RNase R wordt aanbevolen voor een ingangs bedrag > 4 μg.
- Verdun totaal RNA tot 4 μg in 39 μL RNase-vrij water in een micro centrifugebuis en meng goed door pipetteren.
- Verdun de RNase R in een aparte buis tot een werkconcentratie van 2 U/μL met 1x RNase R-reactie buffer. Maak alleen genoeg voor direct gebruik.
- Pipetteer 39 μL totaal RNA en 5 μL 10x RNase R-reactie buffer in een reactie buis van 1,5 mL en meng goed door pipetteren (50 μL zal het totale reactievolume zijn). Voeg vervolgens 6 μL RNase R (2 U/μL) toe.
- Stel de pipet in op het volledige reactievolume (50 μL) en meng goed door 10 keer op en neer te pipetteren.
- Plaats de buis gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C. Zorg ervoor dat het volledige reactievolume wordt ondergedompeld in het waterbad.
- Plaats de buis op ijs en ga onmiddellijk verder met RNA Cleanup & concentratie (rubriek 2).
2. zuiverende RNA met behulp van een RNA Cleanup en concentrator Kit
Opmerking: Bij het gebruik van RNA van hoge kwaliteit (RIN > 8, DV200 > 80%), kan behandeling met RNase R leiden tot verlies van ongeveer 60% RNA. Met een input van 4 μg wordt geschat dat 2 – 2,5 μg behandeld RNA na sectie 1 overblijft.
- Voordat u begint, bereidt u de RNA-reinigings buffer voor door 48 mL 100% ethanol toe te voegen aan het buffer concentraat en goed te mengen door pipetten. Plaats zuiverings kolommen in Verzamel buisjes (Zie tabel met materialen) en plaats in een buisrek.
Opmerking: Gebruik de volgende Centrifugeer instellingen voor alle volgende stappen: 10000 – 16000 x g. Als DNase I behandeling al is uitgevoerd, Skip DNase I behandeling in dit stadium. - Voeg 2 volumes RNA bindings buffer toe aan het met RNase R behandelde monster en meng goed door pipetteren (totaal volume: 150 μL).
- Voeg 1 volume 100% ethanol toe aan de RNA-bindings buffer en het RNase R-behandelde monster mengsel en meng goed door pipetteren (totaal volume: 300 μL).
- Breng het volledige volume over naar de kolom en centrifugeer de kolom voor 30 s. Gooi de stroom door.
- Voeg 400 μL RNA prep-buffer direct toe aan de kolom, centrifugeer de kolom voor 30 s en gooi de stroom door.
- Voeg 700 μL RNA-reinigings buffer direct toe aan de kolom, centrifugeer de kolom voor 30 s en gooi de stroom door.
- Voeg 400 μL RNA-reinigings buffer direct toe aan de kolom, centrifugeer de kolom 2 minuten en breng de kolom over naar een verse, RNase-vrije 1,5 mL-buis.
- Voeg 11 μL RNase-vrij water direct toe aan de kolom door de pipetpunt recht boven het kolom filter te houden en ervoor te zorgen dat het water alleen landt op het kolom filter.
- Incuberen de kolom gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en Centrifugeer gedurende 1 minuut.
- Voordat u de kolom weggaat, controleert u of er doorheen stroomt in de RNase-vrije buis. Als de elutie succesvol was, winkel monster bij-80 °C of onmiddellijk doorgaan met de voorbereiding van de bibliotheek. Het uiteindelijke totale elutie volume van ongeveer 10 μL wordt gebruikt voor de opbouw van de wisselaar.
Opmerking: Stoppunt: laat RNA bij-80 °C gedurende maximaal 7 dagen voordat u doorgaat met het voorbereiden van de bibliotheek.
3. circRNA bibliotheek prep
Opmerking: Zie tabel met materialen voor Kit, die de meeste reagentia bevat die in deze sectie worden gebruikt.
- rRNA uitputting en fragmentatie
- Breng 10 μL gezuiverd RNA over van stap 2,10 naar een schone put in een nieuwe 96-well 0,3 mL PCR-plaat. Voeg aan de put 5 μL rRNA-bindings buffer toe, gevolgd door 5 μL rRNA-verwijderings mengsel. Pipetteer 10 keer zachtjes omhoog en omlaag om te mengen.
- Afdicht plaat en inbroed gedurende 5 minuten bij 68 °C op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok. Na voltooiing van de incubatie van 5 minuten, plaats de plaat op de Bank en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
- Verwijder de afdichting van de plaat. Voeg toe 35 μL gevortext kamertemperatuur rRNA verwijderings kralen om te monster nemen. Stel de pipet in op 45 μL en Pipetteer op en neer 10 – 20x om grondig te mengen. Incuberen plaat gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Breng de plaat aan op een magnetische standaard en inincuberen op de standaard gedurende 1 min of totdat de oplossing wordt gewist. Breng alle supernatant (~ 45 μL) over naar een nieuwe put op dezelfde plaat of een nieuwe plaat (afhankelijk van het aantal monsters waarmee u werkt).
- Vortex de RNA Cleanup kralen (Zie tabel van de materialen) tot goed gedispergeerd, en voeg 99 μL kralen aan elk monster. Pipetteer op en neer 10x om te mengen. Inbroed de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng de plaat over naar de magnetische standaard en inbroed een extra 5 min of totdat de oplossing wordt gewist. Verwijder alle supernatant van de put en gooi deze weg.
- Met de plaat nog steeds op de magnetische standaard, voeg 200 μL vers bereide 80% EtOH aan de put zonder verstoring van de kralen. Inbroed voor 30 sec., verwijder dan en gooi ethanol weg. Herhaal dit voor een totaal van 2 was's.
- Voeg aan elk goed 11 μL elutie buffer toe en Pipetteer 10 keer omhoog en omlaag om te mengen. Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, en vervolgens overbrengen naar de magnetische stand totdat de oplossing wordt gewist (1 – 5 min).
- Breng 8,5 μL van het supernatant van de put over naar een nieuwe put op dezelfde plaat of naar een nieuwe plaat. Voeg 8,5 μL van de Elute, primer, fragment High mix toe aan elk goed dat monster bevat. Pipetteer 10 keer omhoog en omlaag om grondig te mengen.
- Voor 8 minuten bij 94 °C op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok. Verwijder van Thermocycler wanneer het 4 °C bereikt en centrifugeer kort.
Opmerking: Ga onmiddellijk naar het synthetiseren van het eerste onderdeel cDNA-protocol.
- Synthetiseren van cDNA
- Meng, voor elk monster dat wordt bereid, 9 μL eerste streng synthese mengsel met 1 μL reverse transcriptase (Zie tabel met materialen). Voeg 8 μL van het mengsel toe aan het monster. Pipetteer 6 keer omhoog en omlaag om te mengen.
- Afdichtings plaat en incuberen op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok met de volgende parameters: 25 °C gedurende 10 min, 42 °C gedurende 15 min, 70 °C gedurende 15 min, 4 °C vasthouden. Ga onmiddellijk naar de tweede streng synthese.
- Voeg 5 μL resuspensie buffer toe aan elk monster, gevolgd door 20 μL van de tweede streng Markeer Master Mix. Pipetteer het volledige volume 6 keer omhoog en omlaag.
- Afdichtings plaat en incuberen op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok dat is ingesteld op 16 °C gedurende 1 uur. Na incubatie verwijdert u de plaat van de thermocycler en laat u deze op kamertemperatuur komen.
- Vortex PCR-zuiverings kralen (Zie tabel met materialen) en voeg 90 μL kralen toe aan elk goed van monster. Pipetteer 10 keer omhoog en omlaag om grondig te mengen. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Breng de kraal/monster mix over naar de magnetische standaard en inbroed gedurende 5 minuten of totdat de vloeistof wordt gewist. Verwijder en gooi supernatant weg.
- Voeg aan elk monster 200 μL van 80% EtOH toe. Inincuberen monsters op de magnetische standaard bij kamertemperatuur gedurende 30 s. Gooi de supernatant weg. 1x herhalen.
- Laat kralen drogen bij kamertemperatuur gedurende 6 minuten en haal ze vervolgens uit de magnetische standaard.
- Resuspensie-buffer met parels in 19,5 μL. Pipetteer 10 keer omhoog en omlaag om grondig te mengen. Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, vervolgens overbrengen naar de magnetische standaard en inbroed gedurende 1 minuut of totdat de vloeistof wordt gewist.
- Breng 17,5 μL supernatant over naar een nieuw goed/nieuw plaatje.
Opmerking: Als u niet onmiddellijk doorgaat, kunnen de monsters tot 7 dagen bij-20 °C worden bewaard.
- Meng, voor elk monster dat wordt bereid, 9 μL eerste streng synthese mengsel met 1 μL reverse transcriptase (Zie tabel met materialen). Voeg 8 μL van het mengsel toe aan het monster. Pipetteer 6 keer omhoog en omlaag om te mengen.
- Voorbereiding van de bibliotheek
- Voeg aan elke put met supernatant 12,5 μL A-een mengsel toe. Pipetteer het hele volume 10 keer omhoog en omlaag om te mengen.
- Inbroed de reactie op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok ingesteld op 37 °C met behulp van de volgende parameters: 37 °C gedurende 30 min, 70 °C gedurende 5 min, 4 °C vasthouden. Wanneer monsters 4 °C bereiken, ga dan onmiddellijk naar de ligatie van de adapter.
- Voeg aan elk monster 2,5 μL resuspensie buffer, 2,5 μL van een unieke RNA-adapter en 2,5 μL Ligatie mengsel toe. Pipetteer op en neer 10x om te mengen.
- Inbroed monsters op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok bij 30 °C gedurende 10 minuten.
- Voeg aan elk monster 5 μL stop Ligatie buffer toe en Pipetteer omhoog en omlaag om te mengen.
- Voeg aan elk monster 42 μL gemengde PCR-zuiverings kralen toe en meng grondig. Volg stappen 3.2.6 tot en met 3.2.10, maar verander het resuspensie volume naar 52 μL en het uiteindelijke elutie volume tot 50 μL.
- Herhaal het PCR-zuiverings kraal-protocol opnieuw met de 50 μL elutie uit stap 3.3.6, maar verander het resuspensie volume naar 22 μL en het uiteindelijke elutie volume tot 20 μL.
Opmerking: Als u niet onmiddellijk doorgaat, kunnen de monsters tot 7 dagen bij-20 °C worden bewaard. - Voeg aan elk monster 5 μL PCR-primer cocktail en 25 μL PCR-Master-Mix toe. Meng door 10 keer omhoog en omlaag te pipetteren. Incuberen de reactie op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok met de volgende parameters: 98 °C gedurende 30 sec.; vervolgens 8 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 30 sec. en 72 °C gedurende 30 sec.; dan 72 °C gedurende 5 min, daarna 4 °C vasthouden.
Opmerking: Optimalisatie van het totale aantal PCR-cycli kan nodig zijn voor het genereren van voldoende hoeveelheden bibliotheek voor sequentiëren. - Volg het protocol voor PCR-kraal zuivering (stappen 3.2.4 tot en met 3.2.9), behalve Voeg 50 μL goed gemengde PCR-zuiverings parels toe en verander het resuspensie volume tot 32,5 μL met een eind elutie volume van 30 μL.
Opmerking: De monsters moeten bij-20 °C worden bewaard.
- Kwantificering en kwaliteitscontrole met behulp van een nucleïnezuur analysator
- Laat tapes en reagentia gedurende 30 minuten op kamertemperatuur gaan.
- Meng 2 μL bibliotheek met 2 μL HS D1000 buffer, en voeg toe aan een compatibele goed plaat.
- Dicht strak met compatibele folie afdichting en Vortex gedurende 1 minuut bij 2.000 rpm.
- Spin down en laadplaat op de Analyzer na software prompts.
Opmerking: Bibliotheken moeten ongeveer 260 BP groot zijn.
4. workflow voor gegevensanalyse
- Volgorde RNA-SEQ-bibliotheken (Zie tabel met materialen) voor het genereren van 82 BP gekoppelde-eind leesbewerkingen. Zet onbewerkte sequentiëren van gegevens in de vorm van basecall bestanden (. BCL) naar FASTQs met behulp van de bcl2fastq tool (v 0.2.19).
- Detecteer Circrna's.
Opmerking: Op basis van eerder gerapporteerd bewijs dat een ensemble circrna detectie benadering beter presteert in vergelijking met het gebruik van een enkele detectie tool21,22, raden we aan om meerdere tools te gebruiken voor circrna detectie. Hier werden Circrna's geïdentificeerd met behulp van zes bestaande circRNA Voorspellings algoritmen: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE en DCC, waarbij de aanbevolen parameterinstellingen voor elk algoritme worden toegepast.- Downloaden en installeren van elke circRNA detectie-algoritme op een Linux High Performance Computing-Cluster met behulp van de instructies die door de ontwikkel ontwikkelaars.
- Lijn RNA-SEQ-FASTQs uit tegen het referentie-genoom (GRCh37), waarbij de aligner wordt aanbevolen voor elk gereedschap.
- Na de uitlijning voert u circRNA-detectie algoritmen uit door de respectieve aanbevolen parameterinstellingen toe te passen.
- Elk hulpprogramma zal een bestand met resultaten met meerdere kolommen uitvoeren met de lijst van gedetecteerde Circrna's, de coördinaten van de circRNA en het aantal ondersteunende leesbewerkingen hiervan uitpakken om het aantal kandidaten te kwantificeren dat in elke monster/testvoorwaarde is gedetecteerd.
- Converteer de circRNA-coördinaten uitvoer door CIRI, Mapsplice en DCC naar 0-gebaseerde coördinaten om consistent te zijn met de andere drie algoritmen.
- Selecteer Circrna's met twee of meer ondersteunende Lees-of downstreamanalyses en vergelijkingen. Tabel 1 bevat een overzicht van alle parameters die in onze studie zijn geëvalueerd, samen met het totale aantal sequentiëren leesbewerkingen die voor elk voorbeeld worden gegenereerd.
- Tel voor elke sample/testvoorwaarde het aantal gedetecteerde Circrna's dat is genormaliseerd naar het aantal toegewezen leesbewerkingen dat voor die bibliotheek is gegenereerd, per miljoen. Vat de resultaten samen in de verschillende tools/samples in boxplots, zoals beschreven in de representatieve resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gegevens die zijn gegenereerd met behulp van een in de handel verkrijgbare universele controle RNA (UC) en met behulp van twee bibliotheek voorbereidings kits, die beide een ribo-depletie-stap in hun protocollen bevatten, werden eerst beoordeeld. Met behulp van een analytische workflow (Data Analysis workflow, sectie 4), over het algemeen, werd een hoger aantal Circrna's gedetecteerd in de TruSeq datasets in vergelijking met de Kapa Ones (Figuur 1). Hoewel de ribosomale RNA (rRNA) percentages minder dan 5% in gegevenssets van beide Kits voor lagere input bedragen (1,2 UG), hadden Kapa datasets een hogere rRNA-inhoud voor 4, 5 en 10 UG-ingangen (tabel 2). Vandaar, op basis van het aantal gedetecteerde circRNAs en rRNA depletie-efficiëntie, werden verdere experimenten uitgevoerd met behulp van de TruSeq Kit.
Vervolgens werd de significantie van RNase R voor behandeling getest door vergelijking van de gegevens die zijn gegenereerd uit RNase R voorbehandelde en niet-voorbehandelde bibliotheken. Hiertoe werd totaal RNA geëxtraheerd uit de MG gezonde oudere individuen en sequentiëren van gegevens die werden gegenereerd uit bibliotheken met (N = 3) en zonder (N = 3) voor behandeling met RNase R23 werd vergeleken. Een hoger aantal Circrna's werd consistent geïdentificeerd in de voorbehandelde bibliotheken vergeleken met de niet-voorbehandelde (Figuur 2). Dit wordt verwacht omdat voor behandeling lineaire Rna's verwijdert, waardoor het verrijkend is voor de circRNA-soorten.
Ten derde werd de hoeveelheid input RNA die optimaal zou zijn voor het opsporen van een hogere diversiteit van Circrna's getest. Bibliotheken werden bereid met 1, 2 en 4 μg totale input RNA die werd geëxtraheerd uit MG, OC, en SF hersengebieden, en evenals UC RNA. Vergeleken met de overvloed aan Circrna's die uit elke bibliotheek zijn gedetecteerd, werd de hoogste diversiteit van de circRNA-soorten waargenomen bij gebruik van 4 μg input RNA in vergelijking met 2 en 1 μg (Figuur 3), zoals weergegeven door het aantal unieke circrna's geïdentificeerd. Een voorbehoud om op te merken is dat hoewel verschillende incubatie tijden tijdens de behandeling met RNase R niet werden getest, een trend waarbij een toenemend aantal Circrna's werd gedetecteerd in totaal RNA-ingangen van 1 tot 4 μg werd waargenomen bij het beheersen van alle andere parameters.
Dit geoptimaliseerde protocol werd vervolgens toegepast over meerdere weefsel types om circRNA Abundances te vergelijken. Vijf hersengebieden, waaronder BC, MG, OC, IP en SF, van vier gezonde oudere individuen, werden getest, samen met vier andere weefsel typen, waaronder LV, LU, LN en PA, van zes gezonde donoren. Over het algemeen werd een hogere overvloed aan circrna's waargenomen in de hersenen in vergelijking met andere weefsel typen (Figuur 4), zoals eerder gemeld19,20.
Figuur 1: CircRNA detectie met behulp van TruSeq vs. Kapa totaal RNA Kits. Sequentie gegevens werden gegenereerd voor UC RNA met behulp van twee afzonderlijke Total RNA Library voorbereidings kits, elk met 1, 2, 4, 5 en 10 μg input RNA en ribonuclease R (RNase R) voor behandeling. Het aantal Circrna's dat door de gereedschappen in elk monster is gedetecteerd, is genormaliseerd naar het aantal toegewezen leesbewerkingen per miljoen (Y-as). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: CircRNA detectie met en zonder RNase R voor behandeling. Sequentie gegevens die met de TruSeq-Kit werden gegenereerd, werden gebruikt om de impact van RNase R voor behandeling te vergelijken. RNA werd geëxtraheerd uit de middelste temporale gyrus (MG) van gezonde ouderen controles voor deze analyse. Het genormaliseerde aantal Circrna's dat is gedetecteerd (Y-as) werd op dezelfde manier berekend als Figuur 1. RNase R + = voorbehandeld met RNase r, RNase R-= niet voorbehandeld met RNase R. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: CircRNA detectie met behulp van verschillende hoeveelheid input RNA. Met behulp van RNA geëxtraheerd uit MG, occipitale cortex (OC), en superieure frontale gyrus (SF), evenals UC RNA, het aantal unieke circRNAs gedetecteerd bij het gebruik van 1, 2, en 4 μg input RNA, elk waarvan de bibliotheek werd gebouwd met behulp van de TruSeq Kit en RNase R voor behandeling, werd vergeleken. Het genormaliseerde aantal Circrna's dat is gedetecteerd (Y-as) werd op dezelfde manier berekend als Figuur 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: CircRNA detectie in hersenen versus andere weefsel typen. CircRNA verrijkte datasets met behulp van RNA geëxtraheerd uit verschillende hersengebieden, waaronder cerebellum (BC), inferieure pariëtale LOB (IP), MG, OC en SF, evenals vier andere weefsel typen, waaronder lever (LV), Long (LU), lymfeklieren (LN) en alvleesklier (PA) werden gegenereerd. CircRNA verrijking werd uitgevoerd met de Illumina TruSeq Kit met RNase R voor behandeling en 4 μg totaal input RNA. Vak plots vertegenwoordigen het aantal Circrna's gedetecteerd door ten minste drie van de zes instrumenten over de monsters van elke hersenregio/weefseltype. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Test # | Parameter geëvalueerd | Test omstandigheden | Monsterbron | Invoer bedragen/voorwaarden/monsters getest | Het totale aantal leesbewerkingen voor sequentiëren |
| 1 | Bibliotheek Voorbereidingspakket | Illumina TruSeq stranded totaal RNA vs. de Roche Kapa totaal RNA Kits | Uc | TruSeq: 1 μg | 8, 91, 46128 |
| TruSeq: 2 μg | 7, 93, 90202 | ||||
| TruSeq: 4 μg | 6, 66, 12238 | ||||
| TruSeq: 5 μg | 7, 88, 56902 | ||||
| TruSeq: 10 μg | 6, 61, 06874 | ||||
| Kapa: 1 μg | 8, 83, 95496 | ||||
| Kapa: 2 μg | 10, 66, 59272 | ||||
| Kapa: 4 μg | 10, 62, 34954 | ||||
| Kapa: 5 μg | 7, 47, 75914 | ||||
| Kapa: 10 μg | 11, 00, 68504 | ||||
| 2 | Voor behandeling | RNase R voorbehandeld versus niet voorbehandelde | Mg | Pair1: MG_1 (RNase R +) | 10, 76, 09934 |
| Pair1: MG_5 (RNase R-) | 9, 62, 15516 | ||||
| Pair2: MG_2 (RNase R +) | 9, 68, 40790 | ||||
| Pair2: MG_6 (RNase R-) | 10, 16, 09754 | ||||
| Pair3: MG_3 (RNase R +) | 11, 15, 76344 | ||||
| Pair3: MG_7 (RNase R-) | 11, 13, 14114 | ||||
| 3 | Totaal RNA-ingang | 1 μg vs. 2 μg vs. 4 μg | MG, OC, SF, UC | MG: 1 μg | 12,00, 94758 |
| MG: 2 μg | 11, 64, 75728 | ||||
| MG: 4 μg | 12, 13, 15232 | ||||
| OC: 1 μg | 11, 11, 18120 | ||||
| OC: 2 μg | 11, 53, 25492 | ||||
| OC: 4 μg | 11, 49, 13266 | ||||
| SF: 1 μg | 12, 27, 24142 | ||||
| SF: 2 μg | 9, 39, 33288 | ||||
| SF: 4 μg | 12, 33, 31474 | ||||
| UC: 1 μg | 9, 24, 48120 | ||||
| UC: 2 μg | 12, 58, 15354 | ||||
| UC: 4 μg | 12, 56, 92534 | ||||
| 4 | Weefsel typen | Hersengebieden versus andere weefsel typen | BC, MG, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 10, 72, 08904 |
| BC_2 | 11, 18, 33362 | ||||
| BC_3 | 9, 61, 25856 | ||||
| BC_4 | 9, 62, 77094 | ||||
| IP_1 | 9, 86, 56506 | ||||
| IP_2 | 11, 35, 95746 | ||||
| IP_3 | 12, 87, 81536 | ||||
| IP_4 | 9, 59, 81446 | ||||
| MG_1 | 10, 76, 09934 | ||||
| MG_2 | 9, 68, 40790 | ||||
| MG_3 | 11, 15, 76344 | ||||
| MG_4 | 10, 05, 39028 | ||||
| OC_1 | 8, 85, 47042 | ||||
| OC_2 | 12, 09, 83142 | ||||
| OC_3 | 10, 26, 55452 | ||||
| OC_4 | 10, 84, 49330 | ||||
| SF_1 | 8, 76, 21824 | ||||
| SF_2 | 14, 50, 57894 | ||||
| SF_3 | 11, 01, 52030 | ||||
| SF_4 | 9, 67, 24472 | ||||
| LN_1 | 15, 02, 94816 | ||||
| LN_2 | 8, 33, 30187 | ||||
| LN_3 | 11, 30, 96032 | ||||
| LN_4 | 10, 78, 38278 | ||||
| LU_1 | 16, 05, 27595 | ||||
| LU_2 | 8, 94, 30799 | ||||
| LU_3 | 9, 14, 51858 | ||||
| LV_1 | 9, 72, 18369 | ||||
| LV_2 | 10, 54, 16880 | ||||
| LV_3 | 8, 86, 53148 | ||||
| LV_4 | 8, 61, 02943 | ||||
| LV_5 | 12, 87, 88483 | ||||
| LV_6 | 11, 87, 76622 | ||||
| PA_1 | 8, 79, 20160 | ||||
| PA_2 | 7, 82, 36741 | ||||
| PA_3 | 10, 21, 24209 | ||||
| PA_4 | 11, 53, 22926 |
Tabel 1: samenvatting van voorbeeld-en testcondities. Samenvatting van alle parameters en testomstandigheden geëvalueerd in deze studie, samen met het totale aantal sequentiëren leesbewerkingen gegenereerd voor elk voorbeeld. UC = universele controle, MG = middelste temporale gyrus, OC = occipitale cortex, BC = cerebellum, IP = inferieure Pariëtale kwab, SF = superieure frontale gyrus, LU = Long, LV = lever, LN = lymfeklier, PA = alvleesklier, RNase R = ribonuclease R, RNase R + = voorbehandeld met RNase r, RNase R-= niet voorbehandeld met RNase R.
| Monsterbron | Ingevoerde hoeveelheden/monsters getest | Percentage rRNA |
| Uc | TruSeq: 1 μg | 5,53% |
| TruSeq: 2 μg | 4,11% | |
| TruSeq: 4 μg | 4,38% | |
| TruSeq: 5 μg | 3,21% | |
| TruSeq: 10 μg | 3,74% | |
| Kapa: 1 μg | 5,57% | |
| Kapa: 2 μg | 4,56% | |
| Kapa: 4 μg | 9,67% | |
| Kapa: 5 μg | 12,69% | |
| Kapa: 10 μg | 15,59% |
Tabel 2: rRNA percentages in de TruSeq vs. Kapa bibliotheken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werden twee in de handel verkrijgbare bibliotheek voorbereidings kits, voorbehandelings opties en input RNA-bedragen getest om een circRNA-verrijkings protocol voor de bouw van circRNA-sequencing-bibliotheken te optimaliseren. Op basis van de beoordelingen van deze studie, zijn een aantal belangrijke aspecten en kritieke stappen bij het maken van circRNA-sequencing bibliotheken duidelijk. Onze evaluatie bevestigt het nut van RNase R voor behandeling, zoals weergegeven door het toegenomen aantal Circrna's gedetecteerd. Over het algemeen werd een hogere diversiteit van Circrna's waargenomen bij het gebruik van de Illumina TruSeq Library Kit met RNase R voor behandeling en 4 μg input RNA. Deze resultaten zijn afgestemd op eerdere bevindingen dat de RNase R verrijkings stap gunstig is voor de detectie van circRNAs2.
Aanvullende belangrijke aspecten van de circRNA Library Construction omvatten de hoeveelheid totaal RNA die beschikbaar is voor sequencing, evenals het type weefsel waaruit het RNA is geëxtraheerd. Hoewel een input van 4 μg totaal RNA het hoogste aantal gedetecteerde Circrna's oplevert, gebruiken de meeste RNAseq-onderzoeken < = 1 μg totaal RNA, zodat het verkrijgen van hogere bedragen een uitdaging kan zijn, met name voor de analyse van menselijke specimens. De identificatie van Circrna's blijft haalbaar voor lagere input bedragen, maar het is relevant om te erkennen dat de specificiteit van de analyse kan worden beïnvloed. Deze studie benadrukt verder het hogere aantal circrna's dat in het menselijk brein wordt aangetroffen in vergelijking met andere weefsels, zoals eerder gemeld19,20. Het is dus van cruciaal belang om de differentiële uitdrukking van Circrna's in verschillende weefsel typen te erkennen. Bovendien zal aanvullend onderzoek in de context van de ziekte belangrijk zijn om licht te vergieten in hoe Circrna's betrokken kunnen zijn bij pathogene processen.
De prestaties van de twee beoordeelde RNA Library Preparation kits wijzen er ook op dat hoewel verschillende commercieel beschikbare kits significante gelijkenissen kunnen vertonen, er nog steeds verschillen worden waargenomen bij het analyseren van Circrna's. Twee belangrijke bevindingen uit deze vergelijking omvatten een verlaagde rRNA depletie en een lager aantal Circrna's geïdentificeerd met behulp van één benadering. Hoewel een mogelijkheid is dat een hogere overvloed aan rRNA in een monster kan interfereren met het maken van sequentie-able bibliotheek moleculen circRNA, deze bevinding benadrukt de noodzaak om te beoordelen schijnbaar vergelijkbare kits, vooral wanneer reagentia zijn eigendom.
Hoewel de hier gepresenteerde gegevens inzicht bieden in het bestaan en de overvloed van Circrna's in verschillende weefsel typen, heeft deze studie een paar technische beperkingen. Ten eerste, terwijl de behandeling met RNase R de populatie van lineaire Rna's in een monster vermindert, is het niet goed begrepen of deze depletie stap eventuele vooroordelen in circRNA detectie introduceert en of het Circrna's kan afbreken. Eerdere studies hebben gemeld dat circrna's in sommige gevallen gevoelig zijn voor RNase R2,24,25. Ten tweede is het onduidelijk of het verhogen van de totale RNA-input boven 4 μg zal resulteren in een lineaire toename van het aantal geïdentificeerde Circrna's. Zoals eerder vermeld, beschikbaar totaal RNA is vaak beperkt in onderzoeken dus lagere input bedragen werden hier overwogen. Van de opmerking, circRNAs kan nog steeds worden gedetecteerd bij het gebruik van lagere ingangen, maar het is belangrijk om te erkennen dat lagere ingangen worden geassocieerd met detectie van een lager aantal Circrna's. Ten derde, de geoptimaliseerde protocol hier gepresenteerd maakt gebruik van Rna's geëxtraheerd uit een specifieke set van weefsels. Gezien de variabele verdeling van de circRNA-expressie over verschillende weefsel typen, kan de koppeling tussen totale RNA-invoerhoeveelheden en het aantal geïdentificeerde Circrna's verschillen tussen de weefsels.
Met toenemende belangstelling voor het begrijpen van de biologische rol van Circrna's, worden ook nieuwe strategieën ontwikkeld om de karakterisering en identificatie van Circrna's beter mogelijk te maken. Een nieuwe bio-informatica aanpak maakt het mogelijk om circrna's te identificeren die laag kunnen worden uitgedrukt door de reconstructie van circrna's over de hele lengte, en maakt ook kwantificering van expressie van specifieke circrna-isovormen26mogelijk. Deze aanpak maakt gebruik van functies die worden beschreven als reverse overlap (RO) leesbewerkingen die kunnen optreden op de 3 ' of 5 ' uiteinden van de circRNA bibliotheek moleculen. De ontwikkeling van nieuwe strategieën voor het identificeren van Circrna's, die zowel laboratorium benaderingen als bioinformatica tools omvatten, zal bijdragen aan het begrip van de functie en impact van Circrna's in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de banner Sun Health Research Institute Brain and Body donatieprogramma (BBDP) van Sun City, Arizona voor de verstrekking van menselijke hersenweefsels. De BBDP is gesteund door het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte (U24 NS072026 nationale hersenen en weefsel resource voor de ziekte van Parkinson en verwante aandoeningen), het Nationaal Instituut voor veroudering (P30AG19610 Arizona Alzheimer Disease core Center), de Arizona Department of Health Services (contract 211002, Arizona Alzheimer Research Center), de Arizona Biomedical Research Commission (contracten 4001, 0011, 05-901 en 1001 aan het Arizona Parkinson disease Consortium) en de Michael J. Fox Foundation voor onderzoek van Parkinson27. Deze studie werd ook gesteund door de DHS en de staat Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). We bedanken ook Andrea Schmitt (banner Research) en Cynthia lechuga (TGen) voor administratieve ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al.
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al.
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
