Induire une lésion pulmonaire aigue chez la souris par instillation directe du lipopolysaccharide intratrachéal
Summary
Présenté ici est une procédure étape par étape pour induire des dommages aigus de poumon chez les souris par l’instillation intratracheal directe de lipopolysaccharide et pour effectuer l’analyse FACS des échantillons de sang, du fluide de lavage bronchoalveolar, et du tissu de poumon. L’invasivité minimale, la manipulation simple, la bonne reproductibilité, et la titration de la sévérité de la maladie sont des avantages de cette approche.
Abstract
L’administration des voies aériennes du lipopolysaccharide (LPS) est un moyen courant d’étudier l’inflammation pulmonaire et les lésions pulmonaires aigues (ALI) dans les modèles de petits animaux. Diverses approches ont été décrites, telles que l’inhalation de LPS aérosolainsi ainsi que l’instillation nasale ou intratrachéale. Le protocole présenté décrit une procédure étape par étape détaillée pour induire ALI chez les souris par instillation intratracheal directe de LPS et exécuter l’analyse FACS des échantillons de sang, du fluide de lavage bronchoalveolar (BAL) et du tissu de poumon. Après la sédation intrapéritonéale, la trachée est exposée et Le LPS est administré par l’intermédiaire d’un cathéter veineux de 22 G. Une réaction inflammatoire robuste et reproductible avec l’invasion de leucocyte, la mise en réglementation des cytokines proinflammatoires, et la perturbation de la barrière alvéolo-capillaire est induite dans les heures aux jours, selon le dosage de LPS employé. La collecte d’échantillons de sang, de liquide BAL et de récolte pulmonaire, ainsi que le traitement pour l’analyse FACS, sont décrits en détail dans le protocole. Bien que l’utilisation du LPS stérile ne soit pas appropriée pour étudier des interventions pharmacologiques dans les maladies infectieuses, l’approche décrite offre l’invasivité minimale, la manipulation simple, et la bonne reproductibilité pour répondre aux questions immunologiques mécanistes. En outre, la titration de dose aussi bien que l’utilisation des préparations alternatives de LPS ou des souches de souris permettent la modulation des effets cliniques, qui peuvent montrer différents degrés de sévérité d’ALI ou tôt contre début tardif des symptômes de la maladie.
Introduction
Les modèles animaux expérimentaux sont indispensables dans la recherche immunisée fondamentale. L’administration de bactéries entières ou de composants microbiens a été fréquemment utilisée dans les petits modèles animaux pour induire une inflammation locale ou systémique1. Le lipopolysaccharide (LPS, ou endotoxine bactérienne) est un composant de la paroi cellulaire et l’antigène de surface des bactéries gramnégatives (p. ex. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., ou Legionella spp.). La molécule thermostable et grande (poids moléculaire 1-4 x 106 kDa) se compose d’une moiety lipidique (Lipid A), région centrale (oligosaccharide), et un polysaccharide O (ou O antigène). Lipid A, avec ses chaînes d’acides gras hydrophobes, ancre la molécule dans une membrane bactérienne et médiatise (sur la dégradation des bactéries) l’activité immunologique et la toxicité du LPS. Après s’être lié à la protéine de liaison LPS (LBP), les complexes LPS:LBP ligate le complexe de récepteurs CD14/TLR4/MD2 situé à la surface de nombreux types de cellules, induisant une forte réaction proinflammatoire avec la translocation nucléaire NF-B et la régulation subséquente de cytokine expression2.
Les lésions pulmonaires aigues (ALI) sont définies comme une insuffisance respiratoire hypoxémique aigue avec un œdème pulmonaire bilatéral en l’absence d’insuffisance cardiaque3. L’administration des voies respiratoires de LPS est un moyen commun d’induire une inflammation pulmonaire et ALI4,5,6,7. Bien que la substance stérile ne soit pas appropriée pour étudier les interventions pharmacologiques dans les maladies infectieuses, les questions immunologiques mécanistes peuvent être répondues avec une précision suffisante. L’instillation du LPS dans la trachée induit une réaction inflammatoire robuste avec l’invasion de leucocyte, la régulation version des cytokines proinflammatoires, et la perturbation de la barrière alvéolo-capillaire en quelques heures à jours, selon le dosagedeLPS3, 6,7.
Le protocole présenté décrit une procédure étape par étape détaillée pour induire ALI chez les souris par instillation intratrachéale de LPS. Le modèle a été validé en évaluant l’expression de cytokine, l’invasion de granulocyte de neutrophil, et la fuite intra-alvéolaire d’albumine comme précédemment décrit8.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’invasivité minimale, la manipulation simple, et la bonne reproductibilité sont les dispositifs principaux de l’approche présentée pour induire ALI dans un petit modèle de rongeur. L’utilisation de LPS au lieu de bactéries entières dans les modèles animaux a des avantages. Il s’agit d’un composé stable et pur et peut être stocké sous forme lyophilisée jusqu’à l’utilisation. C’est un stimulant puissant pour les réponses immunitaires innées par l’intermédiaire de la voie de TLR4, et son activité biologiqu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Jan Kleiner et Susanne Schulz d’avoir fourni un soutien technique. Les auteurs reconnaissent l’excellent soutien de l’installation de base de cytométrie de flux à la faculté de médecine de l’Université de Bonn. Les auteurs n’ont reçu aucun financement d’un organisme externe. Une partie des données données dans la section des résultats et représentées dans la figure 3 a déjà été présentée dans une publication précédente8.
Materials
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
Referenzen
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