免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング
Summary
抗体標識、光学クリアリング、および高度光顕微鏡検査の組み合わせにより、完全な構造または器官の3次元解析が可能になります。ここでは、厚い腎臓スライスの免疫標識、エチルシナメートによる光学クリアリング、および3次元腎臓構造の可視化と定量を可能にする共焦点イメージングを組み合わせる簡単な方法です。
Abstract
光学クリアリング技術は、その後の3次元(3-D)イメージングのためにサンプル全体で屈折率を平衡化することにより、組織を透明にします。彼らは、顕微鏡的な距離にわたって広がる顕微鏡多細胞構造を分析する可能性について、すべての研究分野で大きな注目を集めています。腎臓の管、血管、神経、糸球体が多くの方向に広がっていることを考えると、これまで伝統的な2次元技術によって部分的にしか捕捉されていなかったため、組織のクリアリングは腎臓研究の多くの新しい領域を開きました。光学クリアリング方法のリストは急速に成長していますが、この分野の初心者が特定の研究問題に最適な方法を選択することは困難なままです。ここでは、厚いマウス腎臓スライスの抗体標識を組み合わせた簡単な方法です。安価で非毒性ですぐに使用でき、化学エチルシナメートを用いて光学クリアリング。と共焦点イメージング。このプロトコルは、腎臓を浸透させ、特殊な装置を必要とせずに抗体結合を増加させるために抗原検索ステップを使用する方法について説明します。その応用は、腎臓内の異なる多細胞構造をイメージングする際に提示され、組織への不十分な抗体の浸透をトラブルシューティングする方法に対処される。また、内因性蛍風素をイメージングし、非常に大きなサンプルを取得することの潜在的な困難と、それらを克服する方法についても議論する。この簡単な議定書は3次元のティッシュを研究するための容易なセットアップおよび包括的な用具を提供する。
Introduction
臓器全体や大きな多細胞構造の研究に対する関心の高まりは、透明な組織を3次元でイメージングする光学クリアリング法の開発につながっています。最近まで、全体の構造の細胞数、長さ、または体積を推定する最良の方法は、2次元1の後続の分析のための組織の全身サンプリングに基づく立体または網羅的な連続断面であり、2,3.しかし、これらの方法は時間がかかり、高いレベルのトレーニングと専門知識を必要とします4.光学クリア法は、サンプル全体で屈折率を平衡化して、3-Dイメージング5、6、7の組織を半透明にすることによって、これらの問題を克服する。
いくつかの光学クリア法が開発されており、溶媒ベースと水性ベースの2つのカテゴリーに分類されます。水性ベースの方法は、さらに単純な浸漬8、9、高水和10、11、およびヒドロゲル埋め込み12、13に分けることができる。溶媒ベースの方法は、組織を脱水し、脂質を除去し、屈折率を約1.55の値に正規化する。ほとんどの溶媒ベースの方法の限界は、GFPなどの一般的に使用されるレポータータンパク質の内因性蛍光の消光、溶媒毒性、一部のイメージングチャンバーまたは対物レンズで使用される接着剤を溶解する能力、および組織の収縮脱水14,15,16,17,18,19,20,21.しかし、溶媒ベースの方法は、簡単で時間効率が良く、多くの異なる組織タイプで働くことができます。
水性ベースの方法は、1.38-1.528、11、12、22、23、24の範囲で屈折指数を有する水溶液中の組織の浸漬に依存する.これらの方法は、内因性蛍光レポータータンパク質の放出を維持し、脱水誘発収縮を防ぐために開発されたが、ほとんどの水性ベースのクリアリング方法の限界は、プロトコルのより長い持続時間、組織の拡張、およびタンパク質修飾(すなわち、ScaleA2のような過水化プロトコルにおける尿素によるタンパク質の部分変性)7、11、23、25。ScaleSは、尿素とソルビトールを組み合わせることにより組織膨張に対処し、尿素誘発組織膨張を脱水してバランスをとり、電子顕微鏡10で評価した組織超構造を保存した。組織の収縮または膨張は、構造の絶対サイズ、オブジェクト間の距離、または体積あたりの細胞密度に影響を与えます。したがって、組織の除去時のサイズ変化の測定は、得られた結果7、26を解釈するのに役立ち得る。
一般に、光学クリアリングのためのプロトコルは、前処理、透過性化、免疫標識(必要な場合)、屈折率照合、高度な光顕微鏡によるイメージング(例えば、2光子、共焦点、またはまたは)光シート蛍光顕微鏡)。クリアリングアプローチのほとんどは、神経組織を視覚化するために開発されており、新しい研究は、他の臓器5での応用を検証しています。この包括的なツールは、糸球体27、28、免疫浸潤28、血管系28、および管状セグメントを含む腎臓構造の信頼性と効率的な分析を可能にするために以前に実証されています29、および健康および疾患における糸球体機能および管状リモデリングの理解を深める理想的なアプローチである。
ここで要約すると、腎臓の管状の免疫染色を組み合わせた溶媒ベースの方法です。安価で非毒性で、すぐに使用する化学エチルシナメート(ECi)による光学クリアリング。完全な管の視覚化および定量を可能にする共焦点顕微鏡イメージ投射。この方法は簡単で、市販の抗体の染色と腎臓スライスの抗原検索を組み合わせ、特殊な装置を必要としないため、ほとんどのラボがアクセスできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
光学クリアリング技術は、様々な臓器における微小解剖学の3D可視化と定量化に広く注目されています。ここで、溶媒系クリアリング法(ECi)を、腎臓スライス中の管状全体の3Dイメージング用免疫標識と組み合わせた。この方法は、シンプルで安価で迅速です。しかし、他の研究の質問は、他のクリアリングプロトコル5で最もよく答えられるかもしれません.また、溶媒ベー?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T.S.は、DFGドイツ研究財団(332853055)、エルス・クローナー・フレセニウス・スティフトゥン(2015_A197)、RWTHアーヘン(RWTHリターナープログラム)の医学部からの助成金によって支援されています。V.G.P.は、ドイツのゲッセルシャフトファーネフロロジー、アレクサンダー・フォン・フンボルト財団、オーストラリア国立保健医療研究評議会の研究フェローシップによって支援されています。D. H. E はフォンダシオン・レダックによってサポートされています。R. K. は、DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1,SFB/TRR57,SFB/TRR219)、ノースラインウェストファミリア州(MIWF-NRW)、RWTHアーヘン大学臨床研究学際センター(O3-1)からの助成金によって支えられています。
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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