Быстрая изоляция дорсал Корень Ganglion Макрофаги
Summary
Здесь мы представляем протокол механической диссоциации для быстрого изолировать макрофаги от кислого корневого ганглия для фенотипирования и функционального анализа.
Abstract
Есть растущие интересы для изучения молекулярных и клеточных взаимодействий между иммунными клетками и сенсорными нейронами в корнях печени ганглиев после повреждения периферического нерва. Периферийные моноцитные клетки, в том числе макрофаги, как известно, реагируют на повреждение тканей с помощью фагоцитоза, антигена презентации, и цитокинов релиз. Новые данные причастны вклад дорсального корня ганглиев макрофагов к развитию нейропатической боли и аксонального ремонта в контексте травмы нерва. Быстро фенотипирования (или “быстрой изоляции”) ответ на торсальные корня ганглиев макрофагов в контексте травмы нерва желательно определить неизвестные нейроиммунные факторы. Здесь мы демонстрируем, как наша лаборатория быстро и эффективно изолирует макрофаги от корня в сонто, используя протокол механической диссоциации без ферментов. Образцы хранятся на льду во всем, чтобы ограничить клеточный стресс. Этот протокол гораздо меньше времени по сравнению со стандартным ферментативным протоколом и регулярно используется для нашего анализа сортировки с плавающей с плавающей сортировки с флуоресценцией.
Introduction
Существует в настоящее время значительные доказательства того, что иммунные клетки способствуют невропатической боли после повреждения периферического нерва1,2. Периферических моноцитных клеток, в том числе зрелых макрофагов, как известно, реагировать на повреждения тканей и системной инфекции через фагоцитоз, антиген презентации, и цитокинов релиз. Параллельно нервной травмы индуцированной активации микроглии в спинномозговой рог, макрофаги в спинной корнегганглия (DRG) также значительно расширить после травмы нерва3,4. Примечательно, что есть растущие интересы, чтобы определить, если макрофаги способствуют развитию нейропатической боли после повреждения периферического нерва, взаимодействуя с сенсорными нейронами в DRG5,6,7, 8 , 9 До 9 , 10 Лет , 11. Кроме того, последние исследования также связаны с вкладом DRG макрофагов в аксональный ремонт после повреждения нерва12,13. Другое исследование также предполагает, что макрофаг субпопуляции (т.е., CD11bиLy6Cпривет и CD11b–Ly6Cнизкий /- клетки) может играть иную роль в механической гиперчувствительности14. Таким образом, быстро фенотипирования ответ DRG макрофагов в контексте травмы нерва может помочь нам определить нейроиммунные факторы, способствующие нейропатической боли.
Условно, протокол для изоляции макрофагов в DRG включает в себя несколько шагов, включая ферментативное пищеварение15,16. Этот метод часто занимает много времени и может быть дорогостоящим для крупномасштабных экспериментов. Хотя мягкое пищеварение с коллагеназой II типа (4 мг/мл) и диспация II типа (4,7 мг/мл) в течение 20 мин было рекомендовано ранее15, можно предположить, что клетки после воздействия этого фермента склонны к повреждению клеток или смерти клеток, что может привести к низкой Урожайность. Кроме того, разница в качестве ферментов от партии к партии может еще больше повлиять на эффективность этого процесса. Что еще более важно, макрофаги подвергаются фермент пищеварения может быть нежелательно стимулировали и, таким образом, может быть очень отличается от статуса in-vivo. Изменения потенциально могут осложнить результаты функционального исследования.
Здесь мы описываем протокол без ферментов для быстрого изоляции макрофагов DRG при 4 градусах Цельсия с помощью механической диссоциации. Образцы хранятся на льду, чтобы ограничить клеточный стресс. В результате, наш подход обеспечивает преимущество для поддержания последовательности изоляции, и изолированные клетки, по-видимому, здоровее и менее стимулировали. Мы также представляем доказательства для проверки качества изолированных клеток с помощью анализа сортировки клеток fluorescence (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы вводим новый метод эффективного обогащения изолированных макрофагов от мыши DRG. Обычный подход к изоляции ИММУННых клеток DRG требует ферментативного пищеварения15,18, который в настоящее время заменяется механической гомогенизации в нашем прото?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано: Фонд омицации и исследований (XY); отделение анестезии и периоперационной помощи UCSF (XY); и 1R01NS100801-01 (ГЗ). Это исследование было частично поддержано Лабораторией анализа клеток ЛАБОРАТОРИей анализа клеток через грант от NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
Referenzen
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
