1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석
Summary
이 보고에서는, 우리는 EGFP 및 관심있는 단백질과 공동 으로 transfecting에 의해 배아 쥐 피질 뉴런에 있는 neurite outgrowth를 공부하기 위한 간단한 프로토콜을 기술합니다.
Abstract
Neurite 의 성장은 신경계 발달 중에 신경 회로형성에 근본적인 사건입니다. 가혹한 신경염성 손상 및 시냅스 역기능은 각종 신경 퇴행성 질병 및 나이 관련 변성에서 생깁니다. neurite 파생을 조절 하는 메커니즘의 조사 뿐만 아니라 뇌 발달 과정뿐만 아니라 이러한 신경 장애에 귀중 한 빛을 발산 것 이다. 낮은 형질 감염 효율로 인해, 현재 1 차 포유류 뉴런에서 신경 구이 성 성장에 특정 단백질의 효과 연구 하는 도전. 여기서, 우리는 EGFP및 관심 단백질(POI)을 이용한 1차 쥐 피질 뉴런의 공동 형질전환에 의한 뉴라이트 자생의 조사를 위한 간단한 방법을 설명한다. 이 방법은 EGFP 신호를 통해 POI 형질감염된 뉴런의 식별을 허용하고, 따라서 NEUrite 자성장에 대한 POI의 효과를 정확하게 결정할 수 있다. 이 EGFP 기반 분석법은 신경과성 자성장을 조절하는 경로의 조사를 위한 편리한 접근법을 제공한다.
Introduction
축색과 모수석을 모두 포함한 노이라이트는 신경망 의 확립에 관여하는 뉴런의 돌출부입니다. 신경 신경 발달에 필수적입니다 신경 구이염의 역동적 인 성장. 그러나, 아래 기본 규제 메커니즘 불분명 남아. 특히, 신경성 손상은 다양한 신경 퇴행성 질환과 뇌 손상 후1. 따라서, 다양한 neurite 파생 규제 경로에서 putative 분자의 역할에 대한 조사는 프로세스의 우리의 이해를 향상시킬 것입니다. 더욱이, 다양한 신경 장애에 대한 새로운 치료 표적을 밝혀낼 수 있다. 신경 세포주는 신경세포가 조작하기 쉽고 트랜스펙트2,3으로neurite 의 성장을 포함한 신경 학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델입니다. 그러나, 유전 드리프트는 그들의 생리적인 반응에 있는 변이로 이끌어 낼 수 있던 몇몇 일반적으로 이용되는 세포주에서 생기기 위하여 보고되었습니다4. 더욱이, 차동 단백질 발현은 신경 세포주와 1차 뉴런 사이에 나타났다. 예를 들어, PC12는, 쥐 부신에서 유래된 뉴런 세포주는 뉴라이트자생을연구하는 데 널리 사용되는2, 3,NMDA 수용체5를발현하지 않는다. 더욱이, 1차 뉴런에 비해 신경독소에 대한 마우스 신경아세포종 라인 신경-2a의 반응성이 감소된 것은 특정 막 수용체 및 이온채널(6)의발현 부족으로 인한 것으로 제안되었다. 따라서, 1차 뉴런은 신경외식 의 자생의 조사를 위한 보다 바람직하고 대표적인 모델이다. 그러나, 1 차적인 뉴런의 사용은 그들의 낮은 형질 감염 효율성7에의해 방해된다.
여기서, 우리는 관심 있는 단백질(POI) 및 EGFP를 1차 쥐 피질 뉴런에 대한 공동 형질감염과 수반하는 방법을 기술한다. EGFP는 성공적으로 형질 감염된 뉴런의 식별을 위한 형태학적 마커로서 작용하고 신경염의 측정을 허용한다. 우리는 neurite 의 성장을 조절하기 위해 보고 된 화합물 / 분자를 사용하여이 방법을 검증했습니다. 더욱이, FE65, 신경조절 단백질은 신경질성 자성장을 자극하는 것으로 나타났으며, 이러한접근법을설명하기 위해8,9를사용하였다. 이 프로토콜은 (1) 배아 18일(E18) 래트 배아로부터 1차 피질 뉴런의 분리, (2) EGFP및 POI(본 연구에서 FE65)를 이용한 뉴런의 공동 형질감염 및 (3) 이미지 처리를 이용하여 뉴런의 이미징 및 분석을 포함한다. 소프트웨어 이미지J 와 뉴런J 플러그인10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
앞서 언급한 바와 같이, PC12 및 그 서브클론은 형질전환 효율이 우수하기 때문에 뉴라이트 확장을 연구하기 위해 널리 사용된다2,3. 대조적으로, 1 차적인 뉴런은 형질전환7에의하여 neurite 파생 조정자를 공부하기 위한 중요한 장애물인 낮은 형질감염 비율을 가시합니다. 여기서, 우리는 1 차적인 뉴런에 있는 neurite 파생을 정량화하기 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 연구 보조금 위원회 홍콩, 건강 및 의료 연구 기금 (홍콩), CUHK 직접 보조금 제도, 유나이티드 대학 기부 기금 및 TUYF 자선 신탁의 기금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
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