Возмущение эндотелиальной биомеханики через Connexin 43 Структурные нарушения
Summary
Здесь мы представляем протокол на основе механики, чтобы нарушить разрыв соединения connexin 43 и измерить последующее воздействие это оказывает на эндотелиальной биомеханики через наблюдение тяги и межклеточных напряжений.
Abstract
Эндотелиальные клетки были созданы для генерации межклеточных напряжений и тяг, но роль разрыв увязов играть в эндотелиального межклеточного стресса и тяги поколения в настоящее время неизвестно. Таким образом, мы представляем здесь механики на основе протокола для зондирования влияния разрыв соединения connexin 43 (Cx43) имеет на эндотелиальной биомеханики, подвергая слияния эндотелиальных монослоев известного ингибитора Cx43 2,5-dihydroxychalcone (халкон) и измерение влияния этого ингибитора на тяги и межклеточные стрессы. Мы представляем репрезентативные результаты, которые показывают снижение как тяги, так и межклеточных напряжений при высокой дозировке халкона (2 мкг/мл) по сравнению с контролем. Этот протокол может быть применен не только к Cx43, но и к другим развязкам, при условии использования соответствующего ингибитора. Мы считаем, что этот протокол будет полезен в области сердечно-сосудистых и механобиологических исследований.
Introduction
Поле, которое относится к изучению влияния физических сил и механических свойств на клеточной и тканевой физиологии и патологии известен как механобиология1. Несколько полезных методов, которые были использованы в механобиологии являются монослой нойелии стресс микроскопии и тяговой силы микроскопии. Микроскопия силы тяги позволяет вычислять tractions произведенных на интерфейсе клетк-субстрата, пока микроскопия усилия монослой позволяет вычислить межклеточных напряжений произведенных между смежными клетками внутри monolayer2 ,3,4,5,6. Результаты, полученные из предыдущих методов, показали, что механические напряжения, полученные из клеток, играют решающую роль в определении судьбы множества клеточных процессов3,4,5. Например, при воздействии внешней механической силы, группа клеток, мигрирующих как коллектив, может изменить свою морфологию и поляризовать свою форму, чтобы выровнять и мигрировать по направлению прикладной силы, частично генерируя тяги7, 8. Tractions обеспечивают метрику, которая может быть использована для оценки сотрудничности клеток и рассчитывается с помощью микроскопии силы тяги (TFM). Микроскопия силы тяги (TFM) начинает с определением клеточных индуцированных деформаций субстрата последовано за вычислением поля тяги используя математически строгий, механик-основанный вычислительный подход. Так как способность вычислить тяги была вокруг в течение довольно продолжительного времени, исследователи использовали TFM, чтобы выявить влияние tractions на множество процессов, в том числе рак9, заживление ран10 и оценка инженерии сердечной ткань11.
Внедрение ТФМ и МСМ вместе можно разделить на три основных шага, которые должны быть выполнены в следующем порядке: во-первых, определяются гидрогелевые деформации, производимые клетками; во-вторых, тяги восстанавливаются после деформаций гидрогеля; и в-третьих, для вычисления нормальных и сдвига межклеточных напряжений в рамках всего монослойа используется подход конечного элемента. Для вычисления смещений геля изображения флуоресценции с клетками сравнивались с эталонным изображением биса (без клеток) с помощью специально написанной целуются велоциметрии изображения частиц (PIV). Размер кросс-корреляционного окна и перекрытие для анализа PIV были выбраны в 32 х 32 пикселя и 0,5, соответственно. В это время пиксельные сдвиги были преобразованы в микроны путем умножения с коэффициентом преобразования пикселя к микрон (для нашего микроскопа этот коэффициент преобразования составляет 0,65) для получения перемещений в плоскости. Ошибки, связанные с игнорированием внеплановых перемещений, незначительны12,13. После вычисления смещений геля, Есть два типа измерения тяги, которые могут быть использованы, ограниченные тяги и неограниченные тяги8,14. Неограниченные тяги обеспечивают поле тяги для всего поля зрения (включая области с ячейками и без), в то время как ограниченные тяги обеспечивают поле тяги только для областей, которые включают ячейки14. Затем межклеточные напряжения рассчитываются с помощью монослойной стрессовой микроскопии (МСМ), которая является продолжением микроскопии силы тяги. Внедрение МСМ основано на предположении, что локальные тяги, прилагаемые монослой ячеек на интерфейсе клеток-субстрата, должны быть сбалансированы механическими силами, передаваемыми между клетками на интерфейсе ячейки, как того требуют законы Ньютона7 ,12,13. Ключевым предположением здесь является то, что монослой клетки можно рассматривать как тонкий эластичный лист, потому что распределение тяги в монослой еронет и баланс силы не зависит от свойств клеточного материала. Еще одно ключевое предположение состоит в том, что силы тяги уравновешиваются локальными межклеточными нагрузками в оптическом поле зрения (в пределах монослой) и влияние этого силового баланса минимально в дистальной области (вне монослой)13. Таким образом, пограничные условия, определяемые межклеточными нагрузками, смещениями или комбинацией обоих на монослойной границе, имеют решающее значение для выполнения МСМ13. Принимая во внимание приведенную выше информацию, мы используем МСМ для выполнения конечного анализа элементов (FEM) для восстановления максимального основного стресса(максимума)и минимального основного стресса(min)путем вращения плоскости напряжения в каждой точке в монослой. Эти основные стрессы впоследствии используются для расчета 2D среднего нормального межклеточного стресса(макс ймин) /2» и 2D максимального сдвига межклеточного стресса(макс –мин) /2 » в пределах всего монослойного 12,13. Эта процедура описана более подробно Tambe et al.12,13
Монослойная микроскопия стресса (МСМ) позволяет рассчитать межклеточные напряжения клеток, образовавшиеся в пределах монослойной6,7,8,12,13. Эти межклеточные стрессы были предложены, чтобы иметь важное значение для роста тканей и ремонта, заживление ран, и метастазировать рак12,15,16,17. Кроме того, межклеточные стрессы были предложены также иметь важное значение в эндотелиальной миграции клеток и эндотелиальной функциибарьера 17,18. В то время как соединения клеток, такие как узкие соединения и адепты, как было предложено, чтобы играть важную роль в эндотелиальной межклеточной генерации стресса и передачи, роль разрыв соединений остается неуловимым. Разрыв ные соединения физически соединяют соседние клетки и обеспечивают путь для электрического тока и молекул (Злт;1 KDa), чтобы пройти между соседними клетками19,20,21. Хотя эндотелиальные клетки выражают Cx37, Cx40, и Cx43 разрыв узлов19,22, Cx43, возможно, наиболее важным с точки зрения прогрессирования заболевания23. Доказательства важности Cx43 можно найти в том, что генетическое удаление Cx43 у мышей приводит к гипотонии24 и оказывает неблагоприятное воздействие на ангиогенез25. Кроме того, Cx43 был задокументирован, чтобы быть важным для миграции клеток и распространения и в прогрессировании атеросклероза18,22,23,24,25 .
В этом протоколе мы использовали TFM и MSM для исследования того, будет ли тяга и межклеточное напряжение в рамках слияния, эндотелиальный монослой будет влиять на нарушение эндотелиального разрыва соединения Cx43. Мы нарушили Cx43 с 2,5-dihydroxychalcone (халкон), молекула документально ингибировать Cx43 выражение26. Chalcone был использован для того чтобы нарушить Cx43 вместо siRNA по мере того как chalcone было сообщено ранее Ли et al. для того чтобы нарушить выражение Cx4326. Кроме того, мы были особенно заинтересованы в влиянии халкона на эндотелий, как было также сообщается, противовоспалительное и противо-тромбоцитов соединения, которые потенциально могут быть использованы для профилактики и лечения различных сосудистых патологии26. Обработка chalcone была выполнена час после начала эксперимента, chalcone-обработанные monolayers были изображены на итог 6 часов, и обработка изображения была выполнена с custom-written кодом MATLAB для того чтобы обусловить tractions и затем межклеточные Напряжения. Наши результаты показали общее снижение тяги и межклеточных стрессов, предполагая, что Cx43 играет ключевую роль в эндотелиальной биомеханике.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наша группа, как и другие, успешно использует TFM и MSM для зондирования влияния клеточных соединений в различных патологических и физиологических клеточных процессах in vitro7,15,18,27 . Например, Hardin et al. представили очень про…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Университета Центральной Флориды стартовых фондов и Национального сердца, легких, и крови института Национального института здравоохранения в соответствии с наградой K25HL132098.
Materials
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
Referenzen
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Entwicklungsbiologie. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2′,5′-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
