Summary

Измерение активности читиназа в биологических образцах

Published: August 22, 2019
doi:

Summary

Здесь представлен простой метод измерения активности хитиназы в биологических жидкостях, таких как бронхоальвеолярная лаваж или сыворотка.

Abstract

Читиназа являются ферментами, которые расщепляют хитин. Даже при отсутствии хитина млекопитающие имеют значительное количество хитиназах, присутствующих в организме, в том числе на исходном уровне. Точная роль хитиназа не известна, однако считалось, что она играет важную роль в пищеварении и защите организма от содержания хитина и патогенов, соответственно. Последние работы, в том числе наша, показали важную роль хитиназа и хитиназа, как белки в иммунитет хозяина и аллергических заболеваний. Важно отметить, что хитиназа деятельности служат важными биомаркерами тяжести заболевания в широком диапазоне заболеваний, включая тип 2 воспалительных заболеваний, таких как астма и легочный фиброз. Аналогичным образом, пациенты с генетическими расстройствами, как болезнь Гоше имеют значительно повышенный уровень хитиназа, которые не только коррелируют с тяжестью заболевания, но и служат надежным биомаркером для терапевтической эффективности. В описанном здесь протоколе описывается простой, быстрый и простой способ измерения активности хитиназы в образцах БАТ или сыворотки мышей и может быть широко адаптирован к человеческим субъектам и другим типообразуя организмам из-за высокосохранительной природы ферментов.

Introduction

Читин является вторым наиболее распространенным полисахаридом на земле после целлюлозы, выступающей в качестве основного структурного компонента различных организмов, включая экзоскелет насекомых, грибов, дрожжей и водорослей; некоторые позвоночные также имеют хитин1. Читиназы представляют собой семейство ферментов, которые способны разрушать хитин и высоко сохраняются на протяжении всей эволюции в видах, начиная от бактерий до млекопитающих2,3. В дополнение к хитиназы, млекопитающие также имеют хитиназы, как белки, которые похожи на хитиназы в их способности связывать хитин, но отличаются тем, что они не имеют ферментатической способности расщеплять хитин4.

Хотя хитин и хитиназы уже давно изучены, исследования датируются началом 1900-х годов, основное внимание уделяется их роли в насекомых и других беспозвоночных. В самом деле, он не был до 1960-х годов, когда позвоночные были найдены, что хитиназа на всех. Использование цитобиазного анализ, хитиназы были показаны, чтобы быть найдены в пищеварительном тракте ряда позвоночных, включая ящериц и черных дроздов-наблюдение предположил, что из-за потребления хитина содержащих организмов, таких как насекомые5 .

Млекопитающие имеют две ферментативно активные формы хитиназы: кислую хитиназу млекопитающих (AMCase; также известный как CHIT2 и CHIA) и chitotriosidase (CHIT1)4. Оба этих белка способны гидролизовать хитин. Тем не менее, CHIT1 более ферментативно активен у людей, где почти вся активность хитиназы происходит от CHIT1. 4 У мышей, как Chit1 и AMCase почти в равной степени способствовать общей активности хитиназы6. С другой стороны, хитиназоподобные белки не имеют хитиназной активности.

Chit1 в основном выделяется макрофагами и часто считается иммунным ответом на хитинсодержащие патогены7. Фермент также было показано, что участвует в созревании моноцитов в обоих M1 и M2 макрофаг подтипов, даже без присутствия субстрата хитина8. Кроме того, он также может быть вовлечен в созревание других иммунных клеток, включая T помощник типа 2 (Th2) клетки и эозинофилы, как было показано в случае криптококковой инфекции легких9. Эти исследования указывают на сложную роль хитиназав в иммунной системе.

В последние годы, Chit1 уровни были найдены в качестве важного биомаркера прогрессирования для более чем 40 различных заболеваний человека, включая лисосомальные заболевания хранения, инфекционные заболевания, респираторные заболевания, эндокринологические заболевания, сердечно-сосудистые заболеваний, неврологических заболеваний и др. (обзор10). Во многих из этих заболеваний, уровни Chit1 являются сильным предиктором тяжести заболевания и терапевтической эффективности10.

Как хитиназа приобрели репутацию биомаркера для многочисленных заболеваний, включая болезнь Гоше, инструменты и анализы были разработаны для облегчения тестирования на наличие хитиназа. Более старые методы включают процедуру Schales, протокол приспособленный от испытания глюкозы крови, и метод 3.5 динитрозалиловной кислоты (DNS). Тем не менее, эти методы часто чувствительны к времени и технически трудно11. Процедура для обоих из этих испытаний требует уменьшения неорганических окислителей, ferricyanide в случае процедуры Schales например, производя изменение цвета которое можно только измерить спектрофотометрическо. Кроме того, оба теста включают нагревание или кипячение шаг, который является одновременно трудоемким и необходимым для цвета развиваться12,13.

Описано здесь быстрый и простой фторметрический анализ для определения уровня хитиназы в образцах млекопитающих14,15. Два из используемых здесь образцов включают сыворотку и бронхоальвеолярные лавовые жидкости (BAL); хитиназа активность также измеряется в грудном молоке и моче образцов, и техника может быть выполнена в этих типах образцов, а также в любой другой биологической жидкости16,17.

Protocol

Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным IACUC в Медицинской школе йельского университета. 1. Коллекция образцов мышей Анестезия Анестезия мышей с использованием кетамина и ксилазина (100 мг/кг кетамина и 10 мг/к?…

Representative Results

Результаты, показанные здесь, взяты из исследования, измеряя активность хитиназы в сыворотке крови и BAL образцах дикого типа (C57BL/6) и chit1 трансгенных мышей (на фоне C57BL/6), которые переэкспрессируют ген Chit1 на промоторизме доксициклина. Наши данные показывают, что оба образца сыворотки и БА?…

Discussion

Активность читиназа стала важным биомаркером для прогнозирования тяжести заболевания, прогрессирования заболевания, терапевтической эффективности и наличия специфических патогенов18. Хотя многие из давно постулируемых теорий о роли хитиназ не были экспериментально док…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Американской ассоциацией легких и Американского торакального общества награды LS. Авторы искренне хотят поблагодарить доктора Джека Элиаса и доктора Чун Кын Ли за предоставление трансгенных штаммов мыши.

Materials

4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

Referenzen

  1. Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
  2. Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
  3. Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, 1-9 (2012).
  4. Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
  5. Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
  6. Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
  7. Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
  8. Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
  9. Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).
  10. Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
  11. Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
  12. Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).
  13. Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
  14. Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
  15. Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
  16. Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
  17. Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
  18. Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
  19. Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
  20. Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
  21. Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
  22. Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
  23. Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
  24. Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
  25. Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
  26. Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).

View Video