Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario
Summary
Realizar experimentos in vitro para reflejar las condiciones in vivo lo más adecuadamente posible no es una tarea fácil. El uso de cultivos celulares primarios es un paso importante hacia la comprensión de la biología celular en todo un organismo. El protocolo proporcionado describe cómo crecer y cultivar con éxito las neuronas cerebelosas de ratón embrionarios.
Abstract
El uso de cultivos celulares primarios se ha convertido en una de las principales herramientas para estudiar el sistema nervioso in vitro. El objetivo final del uso de este sistema de modelos simplificado es proporcionar un microambiente controlado y mantener la alta tasa de supervivencia y las características naturales de las células neuronales y no neuronales disociadas tanto como sea posible en condiciones in vitro. En este artículo, demostramos un método de aislar las neuronas primarias del cerebelo del ratón en desarrollo, colocándolas en un entorno in vitro, estableciendo su crecimiento y monitoreando su viabilidad y diferenciación durante varias semanas. Este método es aplicable a las neuronas embrionarias disociadas del cerebelo entre los días embrionarios 12-18.
Introduction
Durante varias décadas, las líneas celulares se han utilizado ampliamente como una herramienta de alto rendimiento en estudios preclínicos e investigaciones biológicas. Coste-efectividad, crecimiento rápido, y la reducción del uso de animales vivos son algunos beneficios del uso de estas células. Sin embargo, las alteraciones genéticas y los cambios fenotípicos se acumulan después de varios pasajes in vitro1. La identificación errónea de las líneas celulares y la disparidad genética de las células primarias pueden dar lugar a experimentos irreproducibles y conclusiones falsas2,3,4,5. Por lo tanto, a pesar de algunas similitudes con las células diferenciadas como las neuronas (por ejemplo, neurotransmisores, canales iónicos, receptores y otras proteínas específicas de las neuronas), las líneas celulares neuronales no pueden replicar el fenotipo completo de las neuronas. El uso de neuronas maduras es otra opción; sin embargo, estas células son células postmitoticas no divisorias que son difíciles de propagar en el cultivo. Además, el reingreso en el ciclo celular puede precipitar la apoptosis6.
El cultivo celular tridimensional (3D), los cultivos de rebanadas organotípicas y los cultivos organoides se han desarrollado para proporcionar un entorno en el que las células pueden organizarse en una forma 3D que imita el entorno in vivo. Por lo tanto, la comunicación de célula a célula, la migración, la invasión de células tumorales en los tejidos circundantes, y la angiogénesis se pueden estudiar7. Sin embargo, los costos adicionales de usar proteínas de matriz celular adicional (ECM) o hidrogeles sintéticos como ropa de cama, dificultad en la toma de imágenes y compatibilidad con instrumentos de cribado de alto rendimiento son inconvenientes considerables del cultivo de células 3D. Una desventaja importante del cultivo de rebanadas de tejido organotípico es el uso de un gran número de animales y los efectos adversos de la axotomía, que conduce a la inaccesibilidad de las dianas y factores de crecimiento de los axones, y en consecuencia la muerte neuronal8.
Por lo tanto, un enfoque alternativo, que evita los problemas con las líneas celulares, la dificultad del crecimiento de las células maduras y la complejidad de los tejidos, es la maduración in vitro de células primarias inmaduras. Las células primarias se derivan directamente del tejido humano o animal y se disocian utilizando métodos enzimáticos y/o mecánicos9. Los principios principales de aislamiento, sembrado y mantenimiento en el medio de cultivo son similares independientemente de la fuente de tejido. Sin embargo, los factores tróficos necesarios para promover la proliferación y la maduración son altamente específicos de las células6.
Conocer la “fecha de nacimiento” de cada tipo de célula cerebelosa es un requisito previo para diseñar un experimento de cultivo primario. En general, las células purkinje (PC) y las neuronas de los núcleos cerebelosos (CN), nacen antes que las células más pequeñas, incluidas las interneuronas (por ejemplo, cesta, células estelares) y las células del gránulo. En ratones, los PC emergen entre el día embrionario (E)10–E13, mientras que las neuronas CN aproximadamente E9–E1210.
Otras neuronas cerebelosas nacen mucho más tarde. Por ejemplo, en ratones, la subpoblación Golgi de interneuronas se genera a partir de VZ a (E14-E18) y las interneuronas restantes (célulade cesta y células estelares) ubicadas en la capa molecular emergen de células progenitoras divisorias en la materia blanca entre los primeros postnatal (P)0–P711. Las células de gránulos se generan a partir de la zona germinal externa (EGZ), una zona germinal secundaria que se deriva del labio rombio rostral y pasa por la división terminal después del nacimiento. Pero antes de que sus precursores surjan del labio rombio de E13-E16, las células ya han migrado rostrally a lo largo de la superficie pia para hacer una capa delgada de células en la superficie dorsal del anlage de cerebelo. Las células macrogliales no neuronales como los astrocitos y los oligodendrocitos, que se originan en el neuroepitelio ventricular, nacen en E13.5-P0 y P0-P7 respectivamente11,12,13,14 ,15. Microglia se derivan de las células mieloides mieloides primitivas de yema-sac entre E8–E10 y después de la invasión en el sistema nervioso central se pueden detectar en el cerebro del ratón por E916.
El método presentado en este artículo se basa en el desarrollado originalmente por Furuya et al. y Tabata et al.17,18, que fue optimizado para el cultivo primario de células Purkinje derivadas de Wistar rat cerebella. Ahora hemos adaptado este método y lo hemos modificado cuidadosamente para estudiar el crecimiento de las neuronas cerebelosas de ratón19. A diferencia de nuestro nuevo protocolo, el medio de disección en frío es el principal tampón de lavado utilizado durante los pasos de disección y disociación antes de añadir el medio de sembrado en el protocolo17de Furuya. Este tampón carece de la nutrición, los factores de crecimiento y las hormonas (todo en el medio Eagle modificado de Dulbecco:mezcla de nutrientes F-12 [DMEM/F12]) que son necesarios para apoyar el crecimiento celular y la supervivencia durante los pasos antes mencionados. Además, sobre la base de nuestra amplia experiencia con cultivos cebelosos primarios murinos, hemos utilizado 500 s de medio de cultivo en cada pozo (en lugar de 1 mL) y aumentado la concentración de tri-yodotironina a 0,5 ng/ml, lo que mejora el crecimiento de las células neuronales, en particular aquellos con un fenotipo celular Purkinje, y promueve el crecimiento de las ramas dendríticas en el cultivo. El método principal que aparece en este artículo se puede aplicar ampliamente a otros pequeños roedores (por ejemplo, ardillas y hámsters) durante el desarrollo embrionario y puede utilizarse para estudiar la neurogénesis cerebelosa y la diferenciación en las diversas etapas embrionarias, que difieren entre especies.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de cultivos primarios es un método bien conocido aplicable a todos los tipos de neuronas17,18,19. En el protocolo presentado, explicamos cómo aislar las neuronas cerebelosas y mantener su viabilidad con una supervivencia óptima in vitro durante un máximo de 3 semanas. El cultivo primario de células cerebelosas, que fueron aisladas en E15-E18, confirma la recolección de tres clases de neuronas grandes: PCs, células …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estos estudios fueron apoyados por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (HM: NSERC Discovery Grant – RGPIN-2018-06040), y Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant n.o 320035), y la ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
Referenzen
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