عزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة Exosome تحمل عامل تحفيز مستعمرة الحبيبية-الضامة من الخلايا الجذعية الجنينية
Summary
تصف هذه الدراسة طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالإكسوسوم التي تحمل عوامل تحفيز مستعمرة الحبيبية المحفزة للمناعة من الخلايا الجذعية الجنينية.
Abstract
الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي خلايا جذعية متعددة القدرات قادرة على التجديد الذاتي والتمايز في جميع أنواع الخلايا الجنينية. مثل العديد من أنواع الخلايا الأخرى، تطلق ESCs حويصلات غشاء صغيرة، مثل الإكسوسومات، إلى البيئة خارج الخلية. Exosomes بمثابة الوسطاء الأساسية للاتصال بين الخلايا وتلعب دورا أساسيا في العديد من العمليات الفسيولوجية (باثو). يعمل عامل تحفيز مستعمرة الحبيبية-الضامة (GM-CSF) كسيتوكين لتعديل الاستجابة المناعية. وجود جنرال موتورز CSF في exosomes لديه القدرة على تعزيز وظيفتها التنظيمية المناعية. هنا، تم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط بشكل ثابت في خط خلية مورين ESC ES-D3. تم تطوير بروتوكول لعزل الحويصلات خارج الخلية عالية الجودة المخصبة بالإكسوسوم (EVs) من خلايا ES-D3 التي تفرط في التعبير عن GM-CSF. وتميزت المركبات الكهربائية المعزولة المخصبة بالإكسوسوم بمجموعة متنوعة من النهج التجريبية. والأهم من ذلك، تبين أن كميات كبيرة من المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسوم موجودة في مركبات الكربون الكلورية المحورة. وعموما، قد تعمل المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم الحاملة للآلية العالمية من مركبات الكربون الهيدروفلورية ك الحويصلات الخالية من الخلايا لممارسة أنشطتها التنظيمية المناعية.
Introduction
ESCs مشتقة من مرحلة الكيسة الأريمية لجنين ما قبل الزرع1. كخلايا جذعية متعددة القدرات، تمتلك ESCs القدرة على التجديد الذاتي والتمييز في أي نوع من الخلايا الجنينية. نظرا لإمكاناتها التنموية الرائعة وقدرتها على الانتشار على المدى الطويل ، فإن ESCs ذات قيمة كبيرة للأبحاث الطبية الحيوية1. ركزت جهود البحث الحالية إلى حد كبير على الإمكانات العلاجية ل ESCs لمجموعة متنوعة من الاضطرابات المرضية الرئيسية ، بما في ذلك مرض السكري وأمراض القلب والأمراض العصبية2و3و4.
ومن المعروف أن خلايا الثدييات ، بما في ذلك ESCs ، تطلق الحويصلات ذات الأحجام المتغيرة للبيئة خارج الخلية ، وتمتلك هذه المركبات الكهربائية العديد من الوظائف الفسيولوجية والمرضية بسبب دورها في الاتصال بين الخلايا5. من بين أنواع فرعية مختلفة من المركبات الكهربائية، exosomes هي الحويصلات غشاء صغيرة أطلقت من أنواع مختلفة من الخلايا في الفضاء خارج الخلية عند الانصهار من مقصورات الغدد الصماء المتوسطة، والهيئات متعددة المركبات (MVBs)، مع غشاء البلازما6. وقد أفيد Exosomes للتوسط في الاتصالات بين الخلايا وتشارك بشكل حاسم في العديد من العمليات الفسيولوجية (باثو)7،8. ترث Exosomes بعض الوظائف البيولوجية من خلاياها الأبوية الخاصة ، لأن الإكسوسومات تحتوي على مواد بيولوجية تم الحصول عليها من السيتوسول ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية. وهكذا، يتم تغليف المستضدات المرتبطة بها أو العوامل التي تحفز الاستجابة المناعية المحددة لمرض معين في exosomes من أنواع معينة من الخلايا9. مهد هذا الطريق للتجارب السريرية استكشاف exosomes المستمدة من الورم كلقاح مضاد للسرطان10.
GM-CSF هو السيتوكين الذي تفرزه أنواع مختلفة من الخلايا المناعية11. تظهر الأدلة الناشئة أن GM-CSF ينشط وينظم الجهاز المناعي ويلعب دورا أساسيا في عملية تقديم المستضد12. على سبيل المثال، يشير تقرير سريري إلى أن GM-CSF يحفز الاستجابة المناعية للأورام كلقاح المساعد13. وقد تم التحقيق في العديد من الاستراتيجيات العلاج المناعي السرطان المستندة إلى GM-CSF لاستغلال النشاط المحفز المناعي قوية من GM-CSF في التجارب السريرية14. من بين هذه, وقد أظهرت لقاح السرطان تتألف من الخلايا السرطانية المشععة GM-CSF إفراز بعض الوعد في مرضى سرطان الجلد المتقدمة عن طريق تحفيز الاستجابات المضادة للخلايا والفكاهية ونخر لاحقة في الأورامالمنتشرة 15.
ولأن الإكسوسومات المشتقة من مركبات الكربون الهيدروفلورية تمتلك أنشطة بيولوجية مماثلة لتلك التي تمتلكها البلدان النامية الأصلية، فربما يمكن أن تعمل الإكسوسومات الحاملة للآلية العالمية-CSF من مركبات الكربون الهيدروفلورية كحواف خالية من الخلايا لتنظيم الاستجابة المناعية. في هذه الورقة، يتم وصف طريقة مفصلة لإنتاج مركبات كهربائية عالية الجودة غنية بالإكسوسوم من ESCs تعبر عن GM-CSF. هذه المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم لديها القدرة على العمل ك الحويصلات التنظيمية المناعية لتعديل الاستجابة المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تظهر هذه الدراسة طريقة فعالة للغاية لإنتاج مركبات EVs الغنية بالإكسوسوم تحمل البروتين المحفز للمناعة GM-CSF ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الآثار التضمين المناعي للمركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم. تشير العديد من الدراسات إلى أن exosomes تظهر وظائف مناعية تنظيمية ومضادة للورم22.</sup…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للسيد Arkadiusz Slusarczyk وكنتاكي شبكة البنية التحتية للبحوث الطبية الحيوية (KBRIN، P20GM103436) للحصول على انتقال صور المجهر الإلكتروني. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنح المقدمة من NIH AA018016-01 (J.W.E.) والصندوق الاستئماني لتحدي أبحاث كومنولث كنتاكي (J.W.E.) وNIS CA106599 وCA175003 (C.L.) وNIS CA198249 (K.Y.) ومنحة أبحاث التنفس المجانية (K.Y.).
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
Referenzen
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?. Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?. PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
