Qui, presentiamo ektacytometry gradiente di ossigeno, un metodo rapido e riproducibile per misurare la deformabilità dei globuli rossi in campioni da pazienti con malattia delle cellule falciformi sotto deossigenazione controllata e riossigenazione. Questa tecnica fornisce un modo per studiare la falce dei globuli rossi e per monitorare l’efficacia del trattamento della malattia delle falciformi.
Nella malattia delle cellule falciformi (SCD), una mutazione a singolo punto nella codifica del gene per la beta-globina provoca la produzione di emoglobina anormale S (HbS). Quando deossigenato, HbS può polimerizzare, formando aste rigide di emoglobina, causando il falciare dei globuli rossi (RBC). Questi RBC malaticci hanno ridotto significativamente la deformabilità, causando vaso-occlusione, che porta a numerose complicazioni cliniche legate sCD, tra cui dolore, ictus, e danni agli organi. Deformabilità RBC è anche ridotta da disidratazione RBC, con conseguente globuli rossi densi che hanno maggiori probabilità di falciare. Ad oggi, non esiste un singolo saggio di laboratorio ampiamente disponibile, rapido e riproducibile in grado di prevedere la gravità della malattia o di monitorare direttamente gli effetti del trattamento per nuove terapie che inducono emoglobina non fetali. In questo studio, descriviamo un protocollo per misurare la deformabilità di RBC in funzione del pO2 che consente la quantificazione del comportamento di falciamento nei pazienti affetti da SCD. Il gradiente di ossigeno ektacytometria misura la deformabilità rBC, espressa come indice di allungamento (EI), in funzione di pO2. Gli RBC sono esposti a uno stress fisso di taglio di 30 Pa durante un ciclo di deossigenazione e di riossigenazione. Vengono prodotti sei parametri di lettura. Di questi, il punto di malattia (PoS), definito come pO2 in cui l’EI massimo (EImax) mostra una diminuzione del 5%, e l’IE minimo durante la deossigenazione (EImin) sono i più informativi, riflettendo pO2 di un singolo paziente in cui iniziano e la deformabilità minima dei globuli rossi di un paziente, rispettivamente. La poS è associata all’affinità di emoglobina di un singolo paziente per l’ossigeno, mentre EImin mostra una forte correlazione con i livelli di emoglobina fetale. Concludiamo che l’ectacytometria del gradiente di ossigeno è una tecnica promettente per monitorare il trattamento dei pazienti con SCD, come biomarcatore per agenti anti-malattia negli studi clinici e preclinici, e un importante strumento per studiare il comportamento nauseante delle RBC individui con tratti SCD e falciformi.
Nella SCD, una mutazione a singolo punto si traduce nella produzione di HbS, che può polimerizzare dopo la deossigenazione. La polimerizzazione HbS causa nauseamento degli RBC e riduce la deformabilità della RBC. La combinazione di sickling RBC e aderenza RBC all’endotelio porta a varie complicazioni SCD, tra cui crisi vaso-occlusive (VOC), ictus, danno d’organo, e anemia emolitica cronica. Anche in condizioni di norma, deformabilità RBC è compromessa in pazienti con SCD. La deformabilità è ulteriormente diminuita a basse concentrazioni di ossigeno. I fattori chiave che determinano la deformabilità alla normsia sono cellule dense, cellule irrorabilmente ammalati (ISC) e cellule disidratate, tutte con un rapporto superficie-volume diminuito1,2,3.
L’ectacytometria è un metodo consolidato per misurare la deformabilità della RBC, ampiamente utilizzato per la diagnosi di anemie emolitiche ereditarie, in particolare membranopatie4. Può anche essere utilizzato per studiare emorologia5,6,7,8,9. Gradiente osmotico ektacytometria, in cui la deformabilità RBC viene misurata durante un continuo cambiamento di osmolalità, è stato utilizzato per studiare SCD per oltre un decennio10,11. La percentuale di emoglobina fetale (HbF) è uno dei più forti inibitori della polimerizzazione HbS perché né l’HbF né il suo tetramero ibrido misto (2s) possono entrare nella fase12del polimero deossicoHbS. Studi recenti suggeriscono che l’aumento dei livelli di HbF nei pazienti affetti da SCD porta a un migliore rapporto superficie-volume, migliorando così lo stato di idratazione e quindi la deformabilità nei pazienti non transfusi11.
Deformabilità RBC è stato studiato in passato come un biomarcatore per le complicanze SCD, ma con risultati contrastanti. Negli studi effettuati trasversalmente e in uno stato stabile, gli individui con livelli più elevati di deformabilità RBC sono stati trovati per avere una maggiore incidenza di osteonecrosi e più crisi di dolore13,14,15. A differenza di questi risultati, rispetto ai valori di stato costante durante un VOC acuto, deformabilità RBC è stata diminuita in studi longitudinali all’interno degli stessi individui16. Questa discrepanza può essere il risultato dello studio della deformabilità RBC in condizioni diverse (cioè durante lo stato stabile rispetto al VOC). La percentuale di cellule falciate è alta all’inizio di un VOC e le cellule vengono rapidamente distrutte con il progredire della crisi, il che può spiegare la differenza tra i dati di incidenza trasversale dello stato costante e i dati longitudinali ottenuti durante il VOC. Tuttavia, altri fattori, come l’aderenza delle sottopopolazioni RBC alla superficie endoteliale, possono anche essere importanti nella comparsa del COV. In SCD, è più clinicamente rilevante misurare la deformabilità durante la deossigenazione, perché vaso-occlusione si verifica tipicamente nelle venule postcapillariiiiche ipossiche e non nella rete microcapillare meno ipossica17. Inoltre, la presenza di ISC può alterare la capacità di un ektacytometer di misurare la deformabilità alla normoxia. La distorsione del modello di diffrazione è causata dagli ISC, che risultano dal non allineamento durante il flusso1,2,3.
Gli approcci alternativi per studiare la fisiofisiologia del VOC includono misurazioni dell’aderenza rBC a una superficie artificiale18, impedimento elettrico a singola cellula citometria del microflusso19, modelli a base microfluidica che combinano quantitativa misurazioni della falce cellulare e del malessere con la reologia a cella singola20e la polimerizzazione indotta dal laser21. Sebbene promettenti, queste tecniche sono costose, laboriose e richiedono un’ampia formazione da parte dell’operatore. Inoltre, i saggi che sono basati sulla morfologia non hanno la capacità di studiare il comportamento cellulare, come la deformabilità, in funzione di un gradiente di ossigeno.
In questo studio, descriviamo un saggio funzionale rapido e riproducibile eseguito con un ektacytometer. Si tratta di una misura ektacytometry di nuova generazione che misura i diversi aspetti qualitativi della deformabilità della RBC espressi come EI durante la deossigenazione (1.300 s) e la rapida riosssigenazione (280 s). Questi intervalli di tempo consentono la formazione di polimeri HbS, e quindi il verificarsi di cambiamenti morfologici e quindi il recupero. La deossigenazione si verifica introducendo gas di azoto, che diminuisce lentamente la tensione di ossigeno nel campione di sangue nel divario tra il bob e la tazza dell’ektacytometer. La deformabilità rBC viene continuamente misurata mentre la tensione di ossigeno viene misurata ogni 20 s per mezzo di un piccolo O2-spotpresente nella parete della tazza. Durante il test, circa 80 pO2 misurazioni sono accoppiate all’EI misurato in quel momento. La pressione dell’ossigeno scende al di sotto di 20 mmHg durante la deossigenazione e la riossigenazione è facilitata dalla diffusione passiva dell’aria ambiente. La configurazione sperimentale del modulo ektacytometer e gradiente di ossigeno ektacytometry è descritta nella Figura 1 e Figura 2. Il principio di ektacytometria si basa sulla dispersione di luce indotta da RBC da un fascio laser. Il risultato è un modello di diffrazione ellittico quando la sollecitazione di taglio viene applicata contemporaneamente (Figura 1).
Qui descriviamo il gradiente di ossigeno ektacytometry, un metodo che può essere utilizzato per studiare il comportamento malato dei globuli rossi da pazienti SCD in una gamma di concentrazioni di ossigeno (Figura 4 e Figura 5). Per ottenere risultati riproducibili, è importante identificare i fattori che influenzano i risultati. Ad esempio, la temperatura ha un grande impatto sulla deformabilità di RBC, principalmente a causa dei suoi effetti sullo spessore della soluzione viscosa (PVP). Si consiglia di eseguire una misurazione di prova all’inizio della giornata per riscaldare accuratamente la macchina a 37 gradi centigradi. Ciò migliorerà la riproducibilità dei risultati. L’osmolarità della soluzione viscosa dovrebbe essere all’interno di una gamma ristretta (282-286 mOsm/kg per PVP), perché l’osmolarità influenza lo stato di idratazione, che a sua volta influisce sulla deformabilità della RBC. Anche il pH e la viscosità del PVP dovrebbero essere strettamente regolamentati. Le differenze di pH e temperatura possono influenzare drammaticamente le curve22. Inoltre, l’acqua rimanente nella tazza, nel bob e nei tubi può causare il lisi degli RBC, con conseguente dati errati, perché verranno misurati meno RBC intatti presenti nella tazza.
Le impostazioni per eseguire l’ektacytometry del gradiente di ossigeno possono essere regolate per rispondere a domande investigative specifiche. Le impostazioni preferite sono elencate nella tabella 1. È stato scelto un tempo di deossigenazione di 1.300 s sulla base di osservazioni che mostrano che l’estensione della deossigenazione non ha comportato un eImin più basso per la maggior parte dei pazienti. Al contrario, l’accorciamento del tempo di deossigenazione ostacolerebbe il potere discriminatorio del gradiente di ossigeno ektacytometry. Il tempo di riossigenazione è stato fissato a 280 s a causa della rapida risoluzione dei polimeri HbS durante la riossigenazione e del ripristino concomitante dell’EI verso valori misurati prima della deossigenazione. Lo stress da taglio è stato impostato su 30 Pa, che è analogo al gradiente osmotico ektacytometry. La riduzione di questo parametro potrebbe ostacolare la potenza discriminante. Il controllo della deossigenazione può essere utilizzato se a ogni campione di paziente viene applicata una serie di velocità di deossigenazione. Nelle nostre impostazioni preferite, questa opzione è stata disattivata perché il tasso di deossigenazione è specifico del paziente a causa dell’unica curva di dissociazione dell’emoglobina. Quindi, accendere il controllo della deossigenazione eliminerebbe questa caratteristica dal saggio. Tuttavia, questa caratteristica di ektacytometria gradiente di ossigeno è ancora sotto inchiesta.
Diversi fattori ben noti influenzano i parametri di ektacytometria del gradiente di ossigeno, vale a dire pH, temperatura e osmolarità. L’ektacytometria, in particolare il PoS, è influenzata da 2,3 diphosphoglycerate (2,3-DPG)22. Inoltre, esiste una chiara correlazione tra %HbF e EImin, e in misura minore PoS (Figura 5A–D). EImax è associato con cellule falciformi a normossia, che può spiegare l’osservazione che poco dopo un VOC, deformabilità RBC a normoxia (EImax), è superiore. Quest’ultimo è causato dalla distruzione delle cellule più malati, e quindi meno rapmalmassi deformabili durante il VOC16. Come illustrato nella Figura 5F, RBC più densamente %denso (definito come RBC con una concentrazione di emoglobina >1,11 mg/mL) sono fortemente correlati con unmassimodi EI inferiore. Ciò indica che le cellule dense sono un fattore importante nella deformabilità di RBC alla normossia, simile ai risultati precedentemente riportati1.
La standardizzazione dei campioni è molto importante per ottenere risultati riproducibili e per distinguere tra genotipi e trattamenti diversi. La correzione del numero di RBC è importante, poiché il numero di CBC influenza l’intensità del modello di diffrazione. Se sono presenti numeri RBC inferiori nello spazio tra il bob e la coppa, la curva si sposterà verso l’alto e verso sinistra. Inoltre, la curva fluttuerà, ostacolando il calcolo accurato dei parametri, in particolare il PoS.
Una limitazione di questa tecnica è che il valore EI rappresenta una media di tutte le cellule, comprese le diverse sottopopolazioni. L’eterogeneità delle popolazioni di RBC nei pazienti affetti da SCD e la sua influenza sulla misurazione dell’ectacytometria sono state studiate intensamente. Ciò ha portato alla standardizzazione in cui la dimensione del modello di diffrazione viene regolata su un valore fisso invece di corretto per il conteggio RBC23,24. È attualmente in fase di studio se questo modo di standardizzazione debba essere applicato o meno anche alle misurazioni di ektacytometria del gradiente di ossigeno.
Diverse tecniche per misurare la deformabilità della RBC in condizioni ipossiche sono state sviluppate sulla base di una fase di deossigenazione che ha avuto luogo al di fuori dell’ektacytometer25,26,27. In queste condizioni, le differenze nel comportamento cellulare non sono state osservate tra pazienti con tratti HbS e controlli sani sotto pH fisiologico25. Ektacytometria gradiente di ossigeno, tuttavia, mostra chiaramente un PoS basso ma evidente in individui con tratti HbS (Figura 4A). Ad oggi, nella pratica clinica di routine, gli unici metodi alternativi per misurare la tendenza delle RBC di un singolo paziente a falciare in vitro includono un test di mmorologia basata sulla falce: le RBC vengono incubate in condizioni che promuovono la polimerizzazione HbS, come bassa tensione di ossigeno o basso pH. Un fissativo viene aggiunto dopo l’incubazione e la percentuale di cellule falciate viene conteggiata manualmente o digitalmente utilizzando la microscopia leggera. Molti studi farmacologici preclinici e in fase iniziale utilizzano il saggio di malattia per generare una variabile di esito secondario per essere in grado di prevedere l’efficacia clinica in SCD28,29,30,31 ,32. Tuttavia, è dispendioso in termini di tempo, la variabilità è elevata e la sensibilità è bassa, la tecnica non è automatizzata e, quindi, laboriosa. Inoltre, i cambiamenti morfologici dovuti alla falciatura potrebbero non correlare bene con i parametri fisiologici, come la deformabilità della RBC, perché è un analisi statico bidimensionale2.
L’ektacytometria del gradiente di ossigeno fornisce un saggio funzionale di falciare che è rapido e riproducibile. Si tratta di un test in vitro che non considera la superficie endoteliale. Tuttavia, fornisce aspetti funzionali del comportamento nauseante e caratteristiche Di RBC, rendendolo una tecnica promettente per gli studi sulle cellule falciformi. Le future applicazioni della tecnica includono il monitoraggio dell’efficacia del trattamento nei pazienti affetti da SCD, che funge da biomarcatore per nuove strategie di trattamento, lo studio del comportamento da malato e il monitoraggio del chimerismo dopo il trapianto di cellule staminali nella SCD.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione Eurostars estar18105 e da una sovvenzione illimitata fornita da RR Mechatronics. Gli autori ringraziano Sisto Hendriks e Jan de zoeten per il loro supporto tecnico.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |