Биомеханическое тестирование тендонов Murine
Summary
Протокол описывает эффективные и воспроизводимые методы биомеханического тестирования на сухожилия мурин с помощью специально подходят 3D печатные светильники.
Abstract
Тендон расстройства являются общими, влияют на людей всех возрастов, и часто изнурительных. Стандартные методы лечения, такие как противовоспалительные препараты, реабилитация и хирургический ремонт, часто терпят неудачу. Для того, чтобы определить функцию сухожилия и продемонстрировать эффективность новых методов лечения, механические свойства сухожилий из животных моделей должны быть точно определены. Модели животных Murine в настоящее время широко используются для изучения заболеваний сухожилий и оценки новых методов лечения тендинопатий; однако, определение механических свойств сухожилий мыши было сложной задачей. В этом исследовании, новая система была разработана для сухожилий механического тестирования, которая включает в себя 3D-печатные светильники, которые точно соответствуют анатомии плечевой кости и кальканеуса для механически испытания сухожилий супраспината и ахиллова сухожилия, соответственно. Эти светильники были разработаны с использованием 3D-реконструкций родной костной анатомии, твердого моделирования и аддитивного производства. Новый подход устранял сбои в работе артефактных захватов (например, сбой при сбое пластины роста, а не в сухожилии), сократил общее время тестирования и повысил воспроизводимость. Кроме того, этот новый метод легко адаптируется для тестирования других сухожилий и сухожилий морина от других животных.
Introduction
Тендон расстройства являются общими и весьма распространены среди старения, спортивные, и активные группы населения1,2,3. В Соединенных Штатах, 16,4 миллиона травм соединительной ткани сообщается каждый год4 и составляют 30% всех травм, связанных с врачом офис посещает3,5,6,7, 8. Наиболее часто затронутые участки включают вращающую манжету, ахиллово сухожилие и сухожилие9. Хотя различные неоперативные и оперативные методы лечения были изучены, в том числе противовоспалительные препараты, реабилитация, и хирургический ремонт, результаты остаются плохими, с ограниченным возвращением к функции и высоким и высоким уровнем отказа5, 6. Эти плохие клинические исходы побудили основные и трансляционные исследования, стремясь понять тендинопатию и разработать новые подходы к лечению.
Тензильные биомеханические свойства являются первичными количественными исходами, определяющими функцию сухожилия. Таким образом, лабораторная характеристика тендинопатии и эффективности лечения должны включать в себя тщательное тестирование сухожилий растяжить свойства. Многочисленные исследования описали методы, чтобы определить биомеханические свойства сухожилий из животных моделей, таких как крысы, овцы, собаки и кролики10,11,12. Тем не менее, несколько исследований были протестированы биомеханические свойства сухожилий мурин, в первую очередь из-за трудностей в захвате небольших тканей для растяжения. Поскольку моделя мрины имеет многочисленные преимущества для механистического изучения тендинопатии, включая генетические манипуляции, обширные варианты реагента и низкую стоимость, необходима разработка точных и эффективных методов биомеханического тестирования мурин.
Для того, чтобы правильно проверить механические свойства сухожилий, ткань должна быть сжата эффективно, без скольжения или артефактного разрыва на интерфейс ехании или разрыв роста пластины. Во многих случаях, особенно для коротких сухожилий, кость сжат на одном конце, и сухожилие сжато на другом конце. Кости, как правило, обеспечены путем встраивания их в такие материалы, как эпоксидная смола13 и полиметилметакрилат14,15. Тендоны часто помещаются между двумя слоями наждачной бумаги, приклеены цианоакрилатом и закреплены с помощью сжатия зажимы (если поперечное сечение плоское) или в замороженную среду (если поперечный сечение большое)15,16,17 . Эти методы были применены к биомеханически испытания мурин сухожилий, но проблемы возникают из-за небольшого размера образцов и соответствия роста пластины, которая никогда не окостенеет18. Например, диаметр плечевой головки мунина составляет всего несколько миллиметров, что затрудняет захват кости. В частности, растяжение тестирования морин супраспинат сухожилие к кости образцов часто приводит к отказу на рост пластины, а не в сухожилия или на сухожилия энтеза. Аналогичным образом, биомеханическое тестирование ахиллова сухожилия является сложной задачей. Хотя ахиллово сухожилие больше, чем другие сухожилия мурин, calcaneus является небольшим, что делает захват этой кости трудно. Кость может быть удалена, а затем захвата двух концы сухожилий; однако, это исключает тестирование сухожилия к кости вложения. Другие группы сообщают захвата calcaneus кости с помощью пользовательских светильников19,20, якорь зажимы21, фиксация в самостоятельной лечения пластикового цемента22 или с помощью конической формы слот22, но эти предыдущие методы по-прежнему ограничены низкой воспроизводимостью, высокой скоростью сбоев и утомительными требованиями к подготовке.
Целью нынешнего исследования было разработать точный и эффективный метод для растяжения биомеханического тестирования сухожилий мурин, уделяя особое внимание супраспинату и ахиллову сухожилиям в качестве примеров. Используя комбинацию 3D-реконструкций из родной костной анатомии, твердого моделирования и аддитивного производства, был разработан новый метод для захвата костей. Эти приспособления эффективно закрепили кости, предотвратили отказ пластины роста, уменьшили время подготовки образца, и увеличили воспроизводимость испытания. Новый метод легко адаптируется для тестирования других сухожилий мурин, а также сухожилий у крыс и других животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модели животных Murine обычно используются для изучения заболеваний сухожилий, но характеристика их механических свойств является сложной и редкой в литературе. Целью этого протокола является описание эффективного и воспроизводимого метода растяжения сухожилий мурин. Новые методы сок?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | Used by authors |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | Testing platform |
| Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% and use as suggested in protocol |
| Fixture to attach grips | Custom made | Used by authors | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | S-8115 | As suggested in protocol |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| MilliQ water (Ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | 100 ml |
| Meshmixer | Autodesk | http://www.meshmixer.com/ | Free engineering software used by authors to refine mesh |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | Precision Prototyping | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | Used by authors with 3D printer | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 2.5 L of 10% PBS |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | Used by authors |
| Scalpel Blade – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Used by authors |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Used by authors |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks Research Subsription | Solid modeling computer-aided design used by authors |
| SuperGlue | Loctite | 234790 | As suggested in protocol |
| Testing bath | Custom made | Used by authors | |
| Thin film grips | Custom made | Used by authors | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 3D printing material used by authors |
| WinTest | WinTest Software | Used by authors to collect data |
Referenzen
- Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
- Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechanisms of tendon injury and repair. Journal of Orthopaedic Research. 33, 832-839 (2016).
- Scott, A., Ashe, M. C. Common Tendinopathies in the Upper and Lower Extremities. Current Sports Medicine Reports. 5, 233-241 (2006).
- Praemer, A., Furner, S., Rice, D. P. Musculoskeletal Conditions in the United States. American Academy of Orthopaedic Surgeons. , (1992).
- Nourissat, G., Berenbaum, F., Duprez, D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nature Reviews Rheumatology. 11, 223-233 (2015).
- Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. 86, 219-224 (2004).
- Sher, J. S., Uribe, J. W., Posada, A., Murphy, B. J., Zlatkin, M. B. Abnormal findings on magnetic resonance images of asymptomatic shoulders. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77, 10-15 (1995).
- Ker, R. F., Wang, X. T., Pike, A. V. Fatigue quality of mammalian tendons. The Journal of Experimental Biology. 203, 1317-1327 (2000).
- Wilson, J. J., Best, T. M. Common overuse tendon problems: A review and recommendations for treatment. American Family Physician. 72, 811-818 (2005).
- Fleischer, J., et al. Biomechanical strength and failure mechanism of different tubercula refixation methods within the framework of an arthroplasty for shoulder fracture. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. 103, 165-169 (2017).
- West, J. R., Juncosa, N., Galloway, M. T., Boivin, G. P., Butler, D. L. Characterization of in vivo Achilles tendon forces in rabbits during treadmill locomotion at varying speeds and inclinations. Journal of Biomechanics. 37, 1647-1653 (2004).
- Cavinatto, L., et al. Early versus late repair of rotator cuff tears in rats. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27, 606-613 (2018).
- Potter, R., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The developing shoulder has a limited capacity to recover after a short duration of neonatal paralysis. Journal of Biomechanics. 47, 2314-2320 (2014).
- Connizzo, B. K., Sarver, J. J., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Effect of Age and Proteoglycan Deficiency on Collagen Fiber Re-Alignment and Mechanical Properties in Mouse Supraspinatus Tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021019 (2013).
- Beason, D. P., et al. Hypercholesterolemia increases supraspinatus tendon stiffness and elastic modulus across multiple species. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22, 681-686 (2013).
- Miller, K. S., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J. Collagen fiber re-alignment in a neonatal developmental mouse supraspinatus tendon model. Annals of Biomedical Engineering. 40, 1102-1110 (2012).
- Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2780-2788 (2018).
- Thomopoulos, S., Birman, V., Genin, G. M. Structural Interfaces and Attachments in Biology. Infection and Immunity. 35, (2013).
- Boivin, G. P., et al. Biomechanical properties and histology of db/db diabetic mouse Achilles tendon. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 4, 280-284 (2014).
- Ansorge, H. L., Adams, S., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Mechanical, Compositional, and Structural Properties of the Post-natal Mouse Achilles Tendon. Annals of Biomedical Engineering. 39, 1904-1913 (2011).
- Shu, C. C., Smith, M. M., Appleyard, R. C., Little, C. B., Melrose, J. Achilles and tail tendons of perlecan exon 3 null heparan sulphate deficient mice display surprising improvement in tendon tensile properties and altered collagen fibril organisation compared to C57BL/6 wild type mice. PeerJ. 6, 5120 (2018).
- Probst, A., et al. A new clamping technique for biomechanical testing of tendons in small animals. Journal of Investigative Surgery. 13, 313-318 (2000).
- Talan, M. Body temperature of C57BL/6J mice with age. Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).
- Newton, M. D., et al. The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon. Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).
- Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55, 44-51 (2014).
- Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).
- Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury. Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).
- Deymier, A. C., et al. The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis. Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).
- Killian, M. L., Thomopoulos, S. Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis. FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).
- Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment. Development. 142, 196-206 (2015).
- Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing. Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).
- Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons. Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).
- Eekhoff, J. D., et al. Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration. Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003 (2017).
- Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice. Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).
- Sikes, K. J., et al. Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).
- Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains. Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).
- Wang, V. M., et al. Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5. Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).
- Zhang, K., et al. Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model. Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).
- Rooney, S. I., et al. Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model. American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).
- Galasso, O., et al. Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears. Arthroscopy – Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).
- Sarver, D. C., et al. Sex differences in tendon structure and function. Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).
- Razmjou, H., et al. Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66 (2011).
