우리는 마우스 전뇌의 오르노티픽 슬라이스 배양에서 유전자 로 코딩된 FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK의 세포 형 특이적 발현에 대한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 뉴런과 성상 세포에서 세포 ATP 수준의 동적 이미징을 위해이 센서를 사용하는 방법을 보여줍니다.
중추 신 경계에서 신경 활동 (CNS) 아데노신 삼인산의 고장에 의해 제공 하는 세포 에너지에 높은 수요를 불러 일으킨다 (ATP). ATP의 큰 몫은 뉴런의 전기 신호에 의해 저하 플라즈마 멤브레인에 걸쳐 이온 그라데이션을 다시 설치하는 데 필요합니다. 성상 세포는 – 빠른 전기 신호를 생성하지 않는 동안 – 신경 활동에 응하여 ATP의 증가 생산을 겪고 그(것)들에게 에너지 대사 산물을 제공해서 활성 뉴런을 지원한다는 기록이 있습니다. 다른 대사 산물에 대한 유전자 부신 센서의 최근 개발은 이제 뉴런과 성상 세포 사이의 이러한 대사 상호 작용의 연구를 가능하게. 여기서, 우리는 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)를 사용하여 마우스 해마 및 피질의 오르노티피 조직 슬라이스 배양에서 ATP 민감성 형광 에너지 전달-(FRET-) 센서 ATeam1.03YEMK의 세포 형 특이적 발현에 대한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 이 센서가 세포 외 칼륨의 증가와 화학 적 허혈의 유도 (즉, 세포 에너지 대사의 억제)에 따라 뉴런과 성상 세포에서 세포 ATP 수준의 변화의 동적 측정을 위해 사용될 수있는 방법을 보여줍니다.
뉴런의 흥분성 전기 적 활성은 주로 나트륨 (Na+) 및 칼륨 (K+)과같은 양이온의 플럭스에 기초합니다. 따라서 이 두 이온의 전기화학적 구배의 유지보수가 신호화에 필요합니다. 이는 세포 밖 공간에서 2 K+를 대가로 세포에서 3 Na+를 압출하는 유비쿼터스 발현 된 전기 제닉 트랜스 멤브레인 펌프인 Na+/K+-ATPase (NKA)에 의해 달성되며, 수송 주기 당 ATP의 한 분자의 소비를요구한다. NKA 이외에, 혈장 막Ca2+-ATPase를 포함하여 몇몇 다른 ATP 소모이온 수송기는, 세포내 Ca2+ 항상성 및 그 수출 에 필수적인 활동 유도한 유입2. 시냅스 소포에서, 공병형 H+-ATPase(v-ATPase)는 이 구획으로 신경 전달 물질 섭취에 필요한 양성자 구배를 생성한다3.
뉴런의 활성은 이렇게 상당한 양의 ATP4를필요로하지만, 그들은 에너지의 저장을위한 상당한 용량을 나타내지 않는다. 대신, 그(것)들은 두뇌에 있는 주요 글리코겐 저장인 이웃 성상 세포와의 신진 대사 상호 작용에 의존하는 것처럼 보입니다5. 그것은 성상 세포 글리코겐 실제로 신경 에너지 요구를 지 탱하는 데 중요 한 역할을 제안 되었습니다.; 그리고 두 세포 유형 간의 제안된 신경 대사 결합의 주요 현상은 신경 활성6,7,8에반응하여 ATP 생산을 증가시키는 성상세포의 능력이다. 성상 세포 -뉴런 락테이트 셔틀 (ANLS)으로 알려진이 가설은 여전히 논쟁의 여지가 있습니다, 다른 연구는 뉴런이자극에대한 응답으로 당해의 자신의 속도를 증가시킬 수 있다는 증거를 제공했기 때문에9,10,신경 – glia 상호 작용을 연구하는 추가 방법 및 접근의 필요성을 반영.
신경-glia 대사 상호 작용을 해명 하는 신경-glia 대사 상호 작용을 해명 하는 신경 및 성상 세포에서 세포 에너지 대사 및 ATP 수준의 조사 긴 뇌 조직에서 살아있는 세포에서 대사 산물 농도의 변화의 변화에 대 한 적합 한 프로브의 부족에 의해 방해 되었습니다. 그러나 지난 10년 동안 ATP, 젖산, 피루바테 및 기타11,12의센서를 포함하여 다른 대사 산물에 대한 새로운 도구 및 새로운 유전자 부화 형광 프로브의 개발에 급증을 제공했습니다. 이러한 도구를 이용하여, 이제 는 세포 ATP 소비와 관련된 질문을 직접 해결할 수 있으며, 단일 세포 수준에서 세포 형 특정 방식으로 세포 형 에너지 레벨의 변화와 관련된 문제를 그대로 뇌조직(13)으로해결할 수 있다.
본 작품에서, 우리는 뉴런과 배양 organotypic 뇌 조각의 성상 세포에 세포성 ATP 역학을 시각화하는 절차를 설명합니다. 우리는 몇주동안 세포 배양에서 유지될 수 있는 마우스 뇌의 뉴런 및 성상세포에서 유전자 부호분석된 ATP-나노센서 ATeam1.03 YEMK(14)의 세포형 특이적 발현을 위해 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)를 사용하는 방법을 보여준다. 배양 된 조직 조각을 덮는 신경교 흉터를 제거하는 방법에 대한 절차가 설명되어, 이는 광학 접근성및 아래 organotypic 조직 층에서 세포의 이미징을 향상시킵니다. 마지막으로, 우리는 ATeam1.03YEMK가 이 준비에 있는 세포 ATP 수준에 있는 변경의 FRET 기지를 둔 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 외과적 뇌 시술을 필요로 하지 않는 주요 장점을 숙주하고, 배양된 뇌 슬라이스에서 센서 및 세포 유형 특이성의 높은 수준의 발현을 제공하며, 다른 바이러스 벡터와 전기천공 또는 형질전환과 같은 다른 방법과 비교하여 세포의 침습성 또는 스트레스를감소시키며, 10,16,17. 또한, 이 프로토콜은 ATP14에대해 낮은 결합 친화도를 제공하는 ATeam1.03의 변형들 중에서도 다른 FRET 기반 나노센서에 적용될 수 있다.
여기서, 마우스 뇌의 골상세포 또는 뉴런에서 ATP 수준의 변화를 측정하기 위한, FRET 기반의 유전자 부호화나노센서(14)인ATeam1.03YEMK의세포형 특이적 발현에 대한 시술을 입증한다15. 예시적인 기록에서, 우리는 세포 외 칼륨 농도의 증가가 뉴런의 ATP 농도의 변화를 초래하지 않는다는 것을 보여주고, 성상 세포 ATP 수준은 이 조작에 응하여 상승합니다. 더욱이, 우리의 결과는 세포 대사의 억제시, ATeam1.03YEMK FRET 비율이 두 세포 유형 모두에서 급격히 감소한다는 것을 입증하여 세포 내 ATP의 급격한 감소를 나타낸다.
오르노티픽 슬라이스 배양물에서 ATeam1.03YEMK의 발현은 적어도 7-10일 동안 조절된 조건 하에서 배양중인 조직의 유지를 필요로 한다. 대안적으로, ATeam1.03YEMK는 또한 급성 으로 단리된 뇌 조직 슬라이스 및 마우스13,15의시신경에서 ATP의 측정을 위해 사용될 수 있다. 그러나 급성 으로 분리 된 조직에서 측정, 유전자 변형 동물의 생성 또는 뇌에 바이러스 벡터의 입체 응용 프로그램을 필요로, 동물 실험 및 엄격한 동물 관리 프로토콜을 포함. 이와 관련하여, ATeam1.03YEMK 발현은 오르노티픽 조직 슬라이스 배양에서 유용하고 가치 있는대안(22,23)을나타낸다. 몇 년 동안, organotypic 조직 슬라이스 배양은 신경 특성, 연결 성 및 개발24,25,26을연구하는 확립 된 모델 시스템으로 서용을 한다. 이들은 일반적인 조직 구조 및 적층(그림1)을유지할 뿐만 아니라 우수한 접근성 및 실험 조건의 직접 제어와 같은 세포 배양의 우대 특성을 숙주한다. Organotypic 조직 슬라이스 배양은 또한 바이러스벡터(27)를이용하여 외국 유전자를 발현하기 위해 일상적으로 사용된다. 바이러스 벡터의 몇몇 모형은 뇌 조직으로 종족을 전달하기 위하여 보고되었습니다16,28. 아데노바이러스 벡터는 신경교 세포에서 높은 발현을 유도하지만, 해마뉴런(16)은아니며, 신경교반응성(17)을생성할 수 있다. 여기서 사용되는 아데노-관련 바이러스 벡터는 좋은대안(15)으로등장하고, 그 효과는 또한생체내 29에서나타났다.
주로 신경 특성의 연구에 사용 되 고 하는 동안, 최근 연구는 organotypic 조직 슬라이스 배양 또한 성상 세포의 분석에 대 한 고용 될 수 있다 설립. 배양된 슬라이스는 일반적으로 반응성 성상 세포층 층(19,30)에 의해 커버되지만, 성상세포는 더 깊은층19,30(그림 5)에서보다 네이티브, 비반응성 형태 및 세포아키텍처를 나타낸다. 본 연구에서, 우리는 적절한 organotypic 조직 층 내에서 네이티브 성상 세포의 더 나은 실험 및 광학 접근성을 초래하는 외부 신경교 흉터의 기계적 제거를위한 절차를 설명합니다. 더욱이, 그것의 제거는 organotypic 조각의 더 깊은 층에서 발현 효험을 향상시킨다; 신경교 흉터가 제거되지 않으면 AAV에 의한 전이가 피상적 세포 층으로 제한되는 경향이 있습니다.
조직 조각에서 실험을 수행 할 때 몇 가지 외부 기계적 요인을 고려해야합니다. 목욕 관류 속도의 변화는 전체 준비의 움직임을 유도하거나 초점의 변화를 유도하여 센서 신호의 인위적인 과도 변화를 초래할 수 있습니다. 더욱이, 성상세포및 뉴런 모두 높은 관류율32,33에의해 부과되는 기계적 변형에 반응하는 것으로 보고되었다. 우리의 손에, 신뢰할 수있는 연동 펌프를 사용하여, 조직과 목표 사이의 식염수의 작고 안정적인 볼륨을 유지와 함께 (반월 상 연골) 여기에 사용되는 관류 속도에서 기준 선 조건 하에서 안정적인 FRET 신호 결과 (1.5-2.5 mL / 분; 그림 8).
본 연구에서, 우리는 또한 ATeam1.03YEMK를 가진 FRET 기지를 둔 화상 진찰이 뉴런과 성상 세포에 있는 ATP 수준을 감시하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다. 세포 ATP의 측정을 위해 이전에 도입된 대안수단은 소위 루시페린-루시퍼라아제분석분석34,35,36,37이다. 그러나 이 접근법은 생물 발광의 이미징을 기반으로 하며 배경 소음 수준이 높기 때문에 다소 낮은 시간및 공간 해상도를 제공합니다. 최근 몇 년 동안 일상적으로 사용되는 또 다른 방법은 이온에 민감한 플루오로포레 마그네슘 그린38,39,40을이용하여 세포내 마그네슘 농도의 변화를 이미징하는 것이었다. 이 접근법은 ATP를 섭취하면 마그네슘의 공동 인자 방출이 초래한다는 관측과 관련이 있습니다. 마그네슘 녹색으로 이미징하면 ATP 수준의 변화에 대한 보조 추정치만 제공합니다. 또한, 마그네슘 그린은 세포내 칼슘의 변화에 민감하며, 이 방법으로 얻은 결과를 해석할 때 또 다른 어려움을 초래합니다.
세포 대사 산물의 직접 이미징을위한 유전자 부호 화 된 나노 센서의 최근 개발, 따라서, 앞으로 큰 단계를 나타냈다11,12. 세포내 ATP36,41, 42,43의측정에 사용할 수 있는 여러 개의 상이한 센서가 생성되었다. 그 중 에는 ATP:ADP 비율42를감지하는 PercevalHR뿐만 아니라 비율메트릭 형광 ATP 표시기 “QUEEN”(41)이 있습니다. 후자의 프로브는 세포의 에너지 상태를 연구하는 데 유용한 도구이지만 pH42의변화를 동시에 측정해야합니다.
ATeam은 여러 변종이 존재하는 나노 센서로 ATP14에대한 구속적 친화성이 다릅니다. 시험관내에서, ATeam1.03YEMK는 37°C에서 1.2 mM의 Kd를 나타내며, 이는 시상하부 및 소뇌34에서 해마37,44,45에이르는 상이한 뉴런 세포 유형에서 결정된 세포 ATP 수준에 가깝다. 큐벳 측정에서 온도를 10°C로 낮추면 ATeam1.03YEMK에서 ATP로의 결합 친화도가 현저하게 감소하여 실온14에서세포 이미징에 적합하지 않을 수 있음을 시사합니다. 그러나 우리의 이전 연구15는,다른 조작에 신경과 성상 세포에서 표현된 ATeam1.03YEMK의 행동 그리고 반응이 거의 생리적 및 실온에서 유사하다는 것을 보여주었습니다, 센서가 두 조건 하에서 세포 내 ATP 수준의 믿을 수 있는 측정을 허용한다는 것을 나타내는. 또한, 우리의 이전 실험은 세포내부발현ATeam1.03YEMK의 pH 민감도를 해결하되, 약 0.1-0.2 pH 단위로 세포내 pH의 변화에 민감하지 않음을 나타냈다. 낮은 mM 범위의 Kd가 우려되는 경우, 대체 ATeam 변형이14,그 중 ATeam (“GO-ATeam”)의 적색 변종 (“GO-ATeam”)의14를사용할 수 있습니다.
ATeam1.03YEMK를 사용한 실험은 세포외 칼륨 농도가 3mMM에서 8mM까지만 증가하면 Organotypic 슬라이스 배양에서 성상 세포에서 ATeam1.03YEMK 비율이 일시적으로 증가한다는 것을 보여줍니다. 이 관찰은 이전 연구15,46을 확인하고 명확하게 성상세포가 ATP 생산의 증가와 활성 뉴런에 의해 칼륨의 방출에 반응한다는 것을 나타냅니다, 대부분 가능성이 Na+/ K+-ATPase및 Na+HCO3의자극의 결과로– cotransporter, 각각47,48. 이와 는 대조적으로, 뉴런은 이전 작업뿐만 아니라15와일치하는 응답을 보여주지 않았다. 그러나 두 세포 유형모두, 15일이전에 도시된 바와 같이 세포 당해 및 미토콘드리아 호흡의 억제에 신속하고 강하게 반응한다. 화학 허혈의 조건에서, ATeam FRET 비율은 세포 ATP의 명목 고갈을 나타내는 새로운 안정 수준으로 떨어졌다. 후자의 결과 제안 두 신경 세포 뿐만 아니라 성상 세포 는 또한 시 냅 스 활성화 또는 신경 전달 물질의 응용 프로그램에 의해 추가 자극 없이 정상 상태 조건 하에서 ATP의 관련 소비를 전시. 종합하면, 우리는 유전자 인코딩 된 나노 센서를 가진 FRET 기반 이미징, 그 중 ATeam1.03YEMK,다른 조건하에서 세포 내 ATP 수준 및 세포 ATP 소비의 변화에 대한 책임이있는 세포 과정을 해명하는 귀중한 접근 방식을 제공 할 것이라고 결론을 내렸다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 전문 기술 지원에 대한 클라우디아 로데리고와 시몬 듀리에게 감사드립니다. 니클라스 제이 게르카우 박사와 조엘 넬슨 M.Sc 오르가노티픽 슬라이스 문화를 준비하는 데 도움을 주신 것에 감사드립니다. 저자의 실험실에서 연구는 독일 연구 협회에 의해 투자되었다 (DFG; 2795년: Ro 2327/13-1 및 SPP 1757: Ro 2327/8-2 에서 CRR; 및 SPP 1757: RL에 젊은 Glia 스타트업 자금).
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
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Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
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Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |