Гломерулярный рост, как Ex Vivo Assay для анализа путей, участвующих в пареталальной активации клеток
Summary
В этой статье описывается метод культивирования и анализа гломерулярных темеальных эпителиальных клеточных заростов инкапсулированных гломерули, изолированных от мышиных почек. Этот метод может быть использован для изучения путей, участвующих в теменной эпителиальной пролиферации клеток и миграции.
Abstract
Активация париетальных эпителиальных клеток (УИК) является одним из ключевых факторов, влияющих на развитие и прогрессирование гломерулокслероза. Ингибирование путей, участвующих в теменной активации эпителиальных клеток, может быть инструментом для ослабления прогрессирования гломерулярных заболеваний. В этой статье описывается метод культуры и анализа теменной эпителиальной клетки нарост инкапсулированных гломерули, изолированных от мышиных почек. После вскрытия изолированных почек мыши, ткань измельчается, а гломерули изолированы сито. Инкапсулированные гломерули собираются, и одиночные гломерули культивируются в течение 6 дней, чтобы получить гломерулярные нарост темеетальных эпителиальных клеток. В течение этого периода, теменной эпителиальной пролиферации клеток и миграции могут быть проанализированы путем определения числа клеток или площади поверхности перерастающей клетки. Этот анализ может поэтому использоваться в качестве инструмента для изучения последствий измененного экспрессии генов у трансгенных или нокаут-мышей или влияние условий культуры на теменные характеристики эпителиального роста клеток и сигнализации. Используя этот метод, важные пути, участвующие в процессе активации теменной эпителиальной клетки и, следовательно, при гломерулокслерозе могут быть изучены.
Introduction
Гломерулярные заболевания являются важной группой заболеваний почек и представляют собой основную причину заболевания почек на конечной стадии (ESRD). К сожалению, конкретные варианты лечения ограничены и прогрессирование в ESRD неизбежна. Гломерулярные заболевания определяются наличием гломерулярных травм и могут быть сгруппированы в воспалительных и невоспалительных заболеваниях. Хотя первоначальное оскорбление отличается, последние исследования показали, что общий клеточный механизм приводит к гломерулярной гиперплазии клеток и в конечном итоге гломерулосклероз во всех гломерулярных заболеваний, независимо от основной причины1,2,3,4.
В частности, было показано, что гломерулоклеротические поражения в основном состоят из активированных темеальных эпителиальных клеток5,,6. В физиологических условиях, теменные эпителиальные клетки плоские тихие эпителиальные клетки, которые выстиляют капсулу Боумана из гломерула. Однако любая гломерулярная травма, вызванная генетическими мутациями (например, специфическими подоцитами или митохондриальными цитопатиями), воспалением или гиперфильтрацией (например, вызванной снижением почечной массы, гипертонией, ожирением или диабетическим меллитом), может вызвать активацию темных эпителиальных клеток. Активированные теметальные эпителиальные клетки размножаются и откладывают внеклеточную матрицу, что приводит к образованию клеточных полумесяцев или склеротических поражений5,,7,,8. Прогрессирование этих процессов приводит к потере функции почек9. Поэтому активация теменной эпителиальной клетки является ключевым фактором в развитии и прогрессировании гломерулосклероза как при воспалительных, так и при невоспалительных гломерулярных заболеваниях1,,2,,3,,4,,10.
Молекулярные процессы, посреднительные темиетальной активации эпителиальных клеток, до сих пор в значительной степени неизвестны. Недавние исследования показывают, что активированные теметальные эпителиальные клетки de novo экспресс CD44, рецептор, который имеет важное значение для активации различных путей, участвующих в клеточной пролиферации и миграции. Кроме того, было показано, что ингибирование CD44 ингибирует активацию теменных эпителиальных клеток и опутывает прогрессирование образования полумесяца и гломерулезплероза у животных моделей воспалительных, а также невоспалительных гломерулярных заболеваний11,,12.
Поскольку активация теменной эпителиальной клетки является ключевым игроком для развития гломерулосклероза и формирования полумесяца, ингибирование этих клеток может замедлить прогрессирование гломерулярных заболеваний. Выяснение молекулярных путей активации теменной эпителиальной клетки может привести к развитию специфических терапевтических вмешательств, которые смягчат образование гиперпластических и гломеруклеротических поражений при гломерулярных заболеваниях.
В экспериментальных моделях животных часто трудно представить доказательства прямого влияния измененного экспрессии генов (модели нокаутирования или трансгенные мышиные модели) или медикаментозного лечения теменных эпителиальных клеток. В обычной выдаваемой мыши наблюдаемые изменения in vivo могут быть объяснены прямыми изменениями в теменных эпителиальных клетках. Однако, поскольку экспрессия генов также изменяется в других типах клеток в мыши, нельзя исключать косвенных эффектов, опосредованных другими типами клеток. Развитие условных кре-локс мышей, управляемых промоутерами, в основном активными в теменных эпителиальных клетках, обеспечило решение в некоторых случаях13. Тем не менее, условные трансгенные модели являются сложными и, хотя более условные линии становятся доступными, для многих обычных нокаут-аут или трансгенных линий мыши еще не условный заменитель.
Для изучения прямого воздействия на теменной эпителиальной клетки, наша группа разработала ex vivo анализ с использованием одного инкапсулированных гломерули изолированы от мышиных почек для измерения и анализа теменной эпителиальной пролиферации клеток и миграции. Этот метод позволит нам определить теменной эпителиальной клетки конкретные эффекты и найти ответственные пути для теменной активации эпителиальных клеток и варианты лечения теста, чтобы ингибировать эту активацию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя протокол, описанный в этой статье, можно использовать одиночные инкапсулированные гломерули для оценки тейетальной эпителиальной пролиферации клеток, которая является следствием тейетальной активации клеток. Эта модель ex vivo позволит нам детально изучить молекулярные пути…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Голландским фондом почек (грант 14A3D104) и Нидерландской организацией научных исследований (грант NWO VIDI: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
Referenzen
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
