Un modèle de vessie murine décentralisé (Ex Vivo) avec le muscle detrusor enlevé pour l'accès direct au Suburothelium pendant le remplissage de la vessie
Summary
Le modèle de vessie sans detrusor permet un accès direct au suburothélium pour étudier les mécanismes locaux de régulation de la disponibilité du médiateur biologiquement actif dans le suburothélium/lamina propria pendant le stockage et l’annulation de l’urine. La préparation ressemble étroitement au remplissage d’une vessie intacte et permet d’effectuer des études de volume de pression sans influences systémiques.
Abstract
Des études antérieures ont établi la libération de substances chimiques à partir de feuilles de muqueuse de la vessie plate apposées dans les chambres ussing et exposées à des changements dans la pression hydrostatique ou extensible mécanique et des cellules urothéliales cultivées sur les changements de pression hydrostatique, extensible, gonflement cellulaire, ou les forces de traînée, et dans le lumen de la vessie à la fin du remplissage. Ces résultats ont mené à l’hypothèse que ces médiateurs sont également libérés dans suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) pendant le remplissage de réservoir souple, où ils affectent des cellules profondément dans la paroi de réservoir souple pour finalement régler l’excitabilité de réservoir souple. Il y a au moins deux limites évidentes dans ces études : 1) aucune de ces approches ne fournit d’informations directes sur la présence de médiateurs dans SubU/LP, et 2) les stimuli utilisés ne sont pas physiologiques et ne récapitulent pas le remplissage authentique de la vessie. Ici, nous discutons d’une procédure qui permet un accès direct à la surface suburothéliale de la muqueuse de la vessie au cours du remplissage de la vessie. La préparation sans détruseur de murine que nous avons créée ressemble étroitement au remplissage de la vessie intacte et permet d’effectuer des études de volume de pression sur la vessie en l’absence de signalisation confondante des réflexes spinaux et du muscle lisse de détruseur. En utilisant le nouveau modèle de vessie sans détrusive, nous avons récemment démontré que les mesures intravesical des médiateurs ne peuvent pas être utilisées comme un proxy à ce qui a été libéré ou présent dans le SubU/LP pendant le remplissage de la vessie. Le modèle permet d’examiner les molécules de signalisation dérivées de l’urothélium qui sont libérées, générées par le métabolisme et/ou transportées dans le SubU/LP au cours du remplissage de la vessie pour transmettre des informations aux neurones et au muscle lisse de la vessie et réguler son excitabilité pendant la continence et la micturition.
Introduction
Le but de ce modèle est de permettre un accès direct au côté submucosal de la muqueuse de la vessie pendant différentes phases de remplissage de la vessie.
La vessie doit s’abstenir de contraction prématurée pendant le remplissage et vider lorsque le volume critique et la pression sont atteints. La continence anormale ou l’annulation de l’urine sont fréquemment associées à une excitabilité anormale du muscle lisse du détruseur (DSM) au cours du remplissage de la vessie. L’excitabilité du DSM est déterminée par des facteurs intrinsèques aux cellules musculaires lisses et par des influences générées par différents types de cellules dans la paroi de la vessie. La paroi de la vessie urinaire se compose d’urothelium (mucosa), de suburothélium (SubU)/lamina propria (LP), de muscle lisse detrusor (DSM) et de sérosa (figure 1A). L’urothélium se compose de cellules parapluie (c.-à-d. la couche la plus externe de l’urothélium), de cellules intermédiaires et de cellules basales (c.-à-d., la couche la plus interne de l’urothélium). Divers types de cellules, y compris les cellules interstitielles, les fibroblastes, les terminaux nerveux afférents, les petits vaisseaux sanguins et les cellules immunitaires résident dans le SubU/LP. Il est largement supposé que l’urothélium de la vessie est un organe sensoriel qui initie la micturition réflexe et la continence en libérant des médiateurs dans le submucosa qui affectent les cellules dans le SubU / LP et le DSM1,2,3. Pour la plupart, ces hypothèses sont basées sur des études qui ont démontré la libération de médiateurs: à partir de morceaux de muqueuse exposés à des changements de pression hydrostatique4,5; à partir de cellules urothéliales cultivées exposées à l’étirement6,7, gonflement des cellules induite par l’hypotonie7 ou forces de traînée8; des bandes isolées de paroi de réservoir souple sur l’activationderécepteur ou de nerf 9,10,11,12,13,14; et dans le lumen de réservoir souple à la fin du remplissage de réservoir souple15,16,17,18,19. Bien que ces études aient été déterminantes pour démontrer la libération de médiateurs lors de la stimulation mécanique des segments de la paroi de la vessie ou des cellules urothéliales cultivées, elles doivent être étayées par des preuves directes de la libération de médiateurs dans la sous-muqueuse qui sont obtenues par des stimuli physiologiques qui reproduisent le remplissage de la vessie. Il s’agit d’une tâche difficile étant donné que le SubU /LP est situé profondément dans la paroi de la vessie entraver l’accès direct à proximité de SubU / LP pendant le remplissage de la vessie.
Ici, nous illustrons un modèle décentralisé (ex vivo) de réservoir souple murine avec le muscle detrusor enlevé13 qui a été développé pour faciliter des études sur les mécanismes locaux de la méchanotransduction qui participent à la signalisation entre l’urothelium de la vessie, DSM et d’autres types de cellules dans la paroi de la vessie. Cette approche est supérieure à l’utilisation de feuilles plates de la paroi de la vessie, de bandes de paroi vésicale ou de cellules urothéliales cultivées, car elle permet des mesures directes à proximité de SubU/LP de médiateurs dérivés de l’urothélium qui sont libérés ou formés en réponse aux pressions physiologiques et aux volumes dans la vessie et évite les changements phénotypiques potentiels dans la culture cellulaire. Il peut être utilisé pour mesurer la disponibilité, la libération, le métabolisme et le transport transurothélial des médiateurs dans SubU/LP à différents stades de remplissage de la vessie (Figure 1B). La préparation peut également être employée pour examiner la signalisation urotheliale et la mécanotransduction dans des modèles des syndromes hyperactifs et underactifs de réservoir souple.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vessie a deux fonctions : le stockage et l’annulation de l’urine. Le fonctionnement normal de ces fonctions exige une bonne détection mécanique du volume et de la pression intraluminesses et la transduction des signaux à travers les cellules de la paroi de la vessie pour réguler l’excitabilité musculaire du détruseur. La muqueuse de la vessie (urothélium) est censée réguler l’excitabilité de la vessie en libérant une variété de molécules de signalisation dans le SubU/LP qui affectent de nombreux types de…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant DK41315.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
Referenzen
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