אנו מציגים פרוטוקול כללי לזיהוי קטעים קצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (SSHHPS) מוטבע polyprotein הנגיפי. SSHHPS מזוהים על ידי הפרוטסים נגיפי ולהפנות את ההרס המיועד של חלבונים מארחים ספציפיים על ידי מספר וירוסים הקבוצה הרביעית.
אנזימים אלפא-ויראליות מסונתז בפוליפפטיד בודד. Polyprotein לא מבניים (nsp) מעובד על ידי פרוטאז nsP2 ציסטאין שלה כדי לייצר אנזימים פעילים חיוניים עבור שכפול נגיפי. הפרוטסים ויראלי הם ספציפיים מאוד ולהכיר מחשוף שמרו רצפים מוטיב האתר (~ 6-8 חומצות אמינו). בכמה וירוסים Group IV, פרוטאז nsP (s) מחשוף מוטיב האתר ניתן למצוא חלבונים מארחים ספציפיים מעורב ביצירת תגובות החיסונית מולדים, במקרים מסוימים, החלבונים ממוקד להיראות מקושרים את הנגיף המושרה פנוטיפים. וירוסים אלה לנצל קטעים קצרים של הומוולוגי רצפי חלבון הפתוגן מארח (SSHHPS) עבור הרס ממוקד של חלבונים מארחים. כדי לזהות SSHHPS ויראלי מחשוף המחשוף באתר רצפי מוטיב ניתן להכניס את הפיצוץ ואת הגנום מארח (s) ניתן לחפש. הפצילות בתחילה ניתן לבחון באמצעות מטוהרים nsP ויראלי פרוטאז והעברת אנרגיה בתהודה הקרינה (לדאוג) מצעים שנעשו ב -E. coli. מצעים הסריג מכילים חלבון פלורסנט תכלת וצהוב ורצף האתר המחשוף (CFP-רצף-YFP). שיטת פרוטאז זו ניתן להשתמש ברציפות בקורא צלחת או ברציפות ב-SDS-דף ג ‘ לים. מודלים של מצעים פפטיד מאוגד ניתן לייצר בסיליקו כדי להנחות את המצע בחירת מחקרים מוטגנזה. CFP/YFP מצעים יש גם מנוצל כדי לזהות מעכבי פרוטאז. אלה בתוך מבחנה ובשיטות סיליקו ניתן להשתמש בשילוב עם בחני מבוסס תא אומר לקבוע אם החלבון המארח הייעודי משפיע על שכפול נגיפי.
עדות של העברה גנטית אופקית מווירוס לארח, או מארח לנגיף, ניתן למצוא במגוון של גנום1,2,3,4. דוגמאות של האנדוזציה ויראלית הם רצפי מרווח crispr שנמצאו מארח חיידקי גנום4. לאחרונה, מצאנו ראיות של רצפי חלבון מארח מוטבע ב polyproteins שאינם מבניים של (+) ssRNA קבוצה הרביעי וירוסים. רצפים אלה בתוך אזורי הקידוד של הגנום הנגיפי ניתן להפיץ באופן כללי. הקטעים הקצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (sshhps) נמצאים בווירוס ומארח5,6. SSHHPS הם באתר המחשוף שמרו רצפי מוטיב המוכרים על ידי הפרוטסים נגיפי כי יש הומולוגיה לחלבונים מארחים ספציפיים. רצפים אלה מכוונים את ההרס של חלבונים מארחים ספציפיים.
בפרסום הקודם שלנו6, הערכנו רשימה של כל החלבונים המארחים שהיו ממוקדים על ידי הפרוטסים ויראלי מצאו כי רשימת היעדים היה לא אקראי (שולחן 1). שתי מגמות היו בבירור. ראשית, רוב הפרוטסים ויראלי כי לחתוך חלבונים מארחים שייך לקבוצה הרביעי וירוסים (24 של 25 מקרים מעורבים הקבוצה הרביעית ויראלית), פרוטאז אחד שייך (+) ssRNA קבוצת השישי וירוסים (HIV, הנגיף החיסוני האנושי)7. שנית, מטרות החלבון המארח להיות גזור על ידי הפרוטסים נגיפי היו מעורבים בדרך כלל ביצירת התגובות החיסונית מולדים רומז כי ביקנים נועדו להרגיז את התגובות החיסונית של הפונדקאי. מחצית החלבונים המארחים ממוקדות על ידי הפרוטסים ויראלי היו רכיבים ידועים של מפלי איתות שיוצרים אינטרפרון (IFN) ו ציטוקינים proinflammatory (שולחן 1). אחרים היו מעורבים בתמלול התאים המארחים8,9,10 או תרגום11. מעניין, Shmakov ואח ‘4 הראו כי רצפי CRISPR רבים מתאים לגנים המעורבים בתוך בניין הפלבאמצע או שכפול4.
הקבוצה הרביעית כוללת, בין היתר, מפלאביריתיים, פיאורנרידיים, מאוזיים, כלוניים , וטוגוניים. מספר פתוגנים חדשים ומתפתחים שייכים לקבוצה IV כגון וירוס Zika (ZIKA), מערב הנילוס (WNV), Chikungunya (CHIKV), חמור תסמונת הנשימה הנשימתית וירוס (סארס) ואת תסמונת הנשימה המזרח התיכון וירוס (מרס). The (+) הגנום ssRNA הוא בעיקרו פיסת mRNA. כדי לייצר את האנזימים הנחוצים לשכפול הגנום, הגנום (+) ssRNA הראשון חייב להיות מתורגם. ב אלפא וירוסים ווירוסים הרביעי של הקבוצה, האנזימים הנחוצים לשכפול מיוצרים ב-polyprotein יחיד (כלומר, nsP1234 עבור VEEV). פוליפרוטאין שאינו מבני (nsP) הוא מעובד פרוטפוליסטי (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) על ידי פרוטאז nsP2 לייצר אנזימים פעילים12 (איור 1). פצילות של פוליפרוטאין על ידי nsP2 פרוטאז חיוני עבור שכפול נגיפי; זה הוכח על ידי מחיקה ומוטזיס בבימויו של האתר של האתר הפעיל ציסטאין של nsP2 פרוטאז13,14. בעיקר, את התרגום של חלבונים נגיפי לפני אירועי שכפול הגנום. לדוגמה, nsP4 מכיל rna התלוי רנ א פולימראז צורך לשכפל את (+) הגנום ssRNA. שכפול הגנום יכול לייצר dsRNA intermediates; intermediates אלה יכולים להפעיל את התגובות החיסונית מולדים של המארח. Thus, וירוסים אלה עשויים לקליב מארח מולדת תגובה חיסונית חלבונים בתחילת זיהום על מנת לדכא את השפעותיו15,16,17.
השתקה יכולה להתרחש ברמה של דנ א, רנ א וחלבון. מה שמשותף לכל אחד ממנגנוני ההשתקה המוצגים באיור 1 הוא ה-DNA הזר הקצר, RNA או רצפי החלבונים משמשים כדי להנחות את ההרס של מטרות ספציפיות כדי להרגיז את תפקידם. מנגנוני ההשתקה הם מקבילה לתוכניות “חיפוש ומחיקה” שנכתבו בשלוש שפות שונות. רצף המחשוף הקצר הוא אנלוגי ל-“מילת מפתח”. לכל תוכנית יש אנזים המכיר את ההתאמה בין הרצף הקצר (“מילת המפתח”) לבין מילה ב”קובץ” שנמחק. לאחר שנמצאה התאמה, קיצוץ האנזים (“מוחק”) את רצף היעד הגדול יותר. שלושת המנגנונים המוצגים באיור 1 משמשים להגנה על המחשב המארח מפני וירוסים, או כדי להגן על וירוס ממערכת החיסון של המחשב המארח.
הפרוטסים ויראלי לזהות מחשוף קצר באתר רצפי מוטיב בין ~ 2-11 חומצות אמינו; ב נוקלאוטידים, זה יתאים 6-33 בסיסים. להשוואה, רצפי מרווח crispr הם ~ 26-72 נוקלאוטידים ו rnai הם ~ 20-22 נוקלאוטידים18,19. בעוד רצפים אלה קצרים יחסית, הם יכולים להיות מזוהים במיוחד. בהינתן מגוון גבוה יותר של חומצות אמינו, ההסתברות של אירוע מחשוף אקראי הוא נמוך יחסית עבור פרוטאז נגיפי הכרת רצפי חלבון של 6-8 חומצות אמינו או יותר. החיזוי של SSHHPS בחלבונים מארחים יהיה תלוי במידה רבה בספציפיות של הפרוטאז הנגיפי הנבדק. אם פרוטאז יש הדרישות הספציפיות רצף קפדנית הסיכוי למצוא רצף האתר מחשוף הוא 1/206 = 1 ב 64,000,000 או 1/208 = 1 ב 25,600,000,000; עם זאת, ברוב הפרוטסים יש אתר משנה טולרנסים (למשל, R או K עשוי להיות נסבל באתר S1). כתוצאה מכך, אין דרישה לזהות רצף בין הרצפים שנמצאו במחשב המארח לעומת הווירוס. עבור מיומנויות ויראליות כי יש דרישות רצף משוחרר יותר (כגון אלה השייכות Picornaviridae) ההסתברות למציאת אתר מחשוף בחלבון מארח עשוי להיות גבוה יותר. רבים מהערכים בטבלה 1 הם ממשפחת פיאורנריים .
&שכטר סימון ברגר משמש בדרך כלל לתיאור השקעים במצע פרוטאז ולאתרי האתר שעליהם הם מאגד, אנו משתמשים בסימון זה לאורך כל הדרך. שאריות במצע כי הם N-טרמינל של scissile bond מסומנים P3-P2-P1 בעוד אלה הם C-טרמינל מסומנים P1′-P2′ P3 ‘. אתרי האתר המתאימים בפרוטאז כי לאגד אלה חומצות אמינו שאריות הם S3-S2-S1 ו-S1′-S2’-S3 ‘, בהתאמה.
כדי לקבוע אילו חלבונים מארחים מיועדים, אנו יכולים לזהות את SSHHPS באתרי המחשוף הנגיפי פוליפרוטאין ולחפש את החלבונים המארחים המכילים אותם. להלן, אנו הליכי מיתאר לזיהוי SSHHPS באמצעות מחשוף הנגיפי פרוטאז האתר רצפים. השיטות הביותטיות, הפרוטאז, ובשיטות סיליקו המתוארות, מיועדות לשימוש בשילוב עם מספר מבוסס-תא.
מערכים רצף של החלבונים המארחים ממוקד על ידי הפרוטסים נגיפי חשפו מינים ספציפיים הבדלים בתוך אלה רצפי מחשוף קצר באתר. לדוגמה, וירוס דלקת קרום המוח של ונצואלה (VEEV) nsP2 פרוטאז נמצא לחתוך את TRIM14 האנושי, מוטיב ה tripartite COMMISSION (TRIM) חלבון6. כמה חלבונים TRIM הם גורמי הגבלה נגיפי (למשל, TRIM5α21), רובם נחשבים אוביקוויב E3 ליגסים. TRIM14 חסרה טבעת (גן מאוד מעניין באמת) התחום והוא אינו נחשב E3 ליגאז22. TRIM14 כבר הציע להיות מתאם בתוך הסימן האנטי ויראלי מיטוכונדריאני (MAVS)22, אבל אולי יש פונקציות אנטי ויראליות אחרות23. היישור של רצפי TRIM14 ממינים שונים מראה כי הסוס חסר באתר המחשוף והנמל גרסה קטומה של TRIM14 כי הוא חסר את ה-C-terminal מתחם/SPRY. תחום זה מכיל אתר polyubiquitination (איור 2). בסוסים, וירוסים אלה הם קטלניים מאוד (~ 20-80% תמותה) ואילו בבני אדם רק ~ 1% למות מזיהומים VEEV24. הפצילות של התחום לחטט/SPRY עשוי להיות קצר ביותר מעגל איתות מתחת ל-MAVS. מפל זה יכול להיות מופעל על ידי dsRNA ומוביל לייצור ציטוקינים אינטרפרון ו pro-דלקתיות. כך, הנוכחות של SSHHPS עשוי להיות שימושי לניבוי איזה מינים יש מערכות הגנה נגד וירוסים מסוימים הרביעי קבוצה.
בווירוסים של הקבוצה הרביעית, מנגנוני האנטוניזם של IFN נחשבים להכפלת25מיותרים. מעטפת חלבון מארח עשוי להיות ארעי במהלך זיהום וריכוזים עשוי להתאושש לאורך זמן. מצאנו בתאים כי מוצרי המחשוף TRIM14 ניתן להבחין מוקדם מאוד לאחר החצייה (6 h) עם קידוד פלבמיד את פרוטאז (cytomegalovirus ירוס מקדם). עם זאת, בתקופות ארוכות יותר, מוצרי המחשוף לא זוהו. בתאים נגועים בווירוס, הקינטיקה היו שונים מוצרי המחשוף יכול להיות מזוהה בין 6-48 h6. אחרים דיווחו על הופעתו של מארח חלבון מוצרי מחשוף מוקדם ככל 3-6 h לאחר הזיהום9,11.
פעילות פרוטחרדה בתאים לעתים קרובות קשה לתפוס; מוצרי המחשוף יכולים להשתנות באמצעות מסיסות, ריכוז, יציבות וחיים. בתוך תא מבוסס assays זה לא ניתן להניח כי מוצרי מחשוף יצטברו בתא או כי עוצמות הלהקה של החלבון גזור ומלא מלוטש יציג מגדילה הפיצוי ופוחתת כמו חלבון לחתוך עלול להיות מושפל מהר מאוד ולא ניתן לגילוי בכתם המערבי במשקל מולקולרי צפוי (MW) (למשל, האזור המכיל את האפירופה יכול להיות ביקע על ידי הפרוטסים מארחים אחרים או יכול להיות אוביקווילי. אם המצע של הפרוטאז הנגיפי הוא חלבון תגובה חיסונית מולדת, הריכוז שלה עשוי להשתנות במהלך הזיהום. לדוגמה, כמה חלבונים מולדים תגובה חיסונית נמצאים לפני זיהום נגיפי הם המושרה עוד על ידי אינטרפרון26. הריכוז של חלבון היעד עשוי אפוא להשתנות במהלך הזיהום והשוואה של ליטים נגועים נגוע לעומת נגוע עלול להיות קשה לפענוח. בנוסף, כל התאים עשויים שלא להיות מזוהמים או נגועים בצורה אחידה. בתוך הפריה חוץ גופית פרוטאז שימוש בחלבונים מטוהרים מ -E. coli מצד שני יש פחות משתנים שעליהם לשלוט וכדומה יכול להיעשות באמצעות sds-PAGE במקום בלוק חיסוני. הפרוטסים מזהם יכול להיות מעוכב בשלבים המוקדמים של טיהור חלבון של המצע CFP/YFP, ומוטציה ויראלי הפרוטסים ניתן לטהר ונבדק כפקדים כדי לקבוע אם המחשוף נובע פרוטאז נגיפי או פרוטאז חיידקי מזהם.
מגבלה אחת של פרוטאז מחוץ לבית הספר היא שאין להם מורכבות של תא יונקים. כדי שאנזים יחתוך את המצע שלו, השניים חייבים להיות מותאמים לשיתוף. שונות ויראלית של קבוצה הרביעית במבנה ובלוקליזציה. לדוגמה, פרוטאז ZIKV מוטבע הממברנה האנדופלזמית (ER) הפנים ופרצופים ציטוסול, בעוד הפרוטאז VEEV nsP2 הוא חלבון מסיס בציטופלסמה ו גרעין27. חלק מהמחשוף שנמצאו בניתוח ZIKV SSHHPS היו בפפטידים של אותות הרומזים כי המחשוף עלול להתרחש במשותף למטרות מסוימות. כך, המיקום של פרוטאז ואת המצע בתא גם צריך להיחשב בניתוחים אלה.
בחני מבוסס התא יכול להיות בעל ערך עבור הקמת תפקיד עבור חלבון מארח מזוהה (s) זיהום. שיטות שמטרתן לעצור מחשוף פרוטאז ויראלי של חלבונים מארחים כגון תוספת של מעכב פרוטאז6 או מוטציה ביעד המארח16 ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעות שלהם על שכפול נגיפי. ביטוי יתר של חלבון ייעודי גם עלול להשפיע על שכפול נגיפי28. הפלאק אומר או שיטות אחרות ניתן להשתמש כדי לכמת שכפול נגיפי.
השמדה ספציפית לרצף של חלבון או חומצת גרעין המודרכת על-ידי רצף זר מראה רק במקרים ספורים בביולוגיה. המנגנונים המוצגים באיור 1 הם מנגנוני הגנה המגנים על המחשב המארח מפני וירוס, או וירוס ממחשב מארח.
שימוש בשיטות ביוטיות ניתן לזהות את המטרות הושמדו על-ידי מערכות אלה. בניתוח שלנו של רצפי SSHHP, גילינו כי רבים מהם ניתן למצוא חלבונים הדרושים כדי ליצור תגובות החיסונית מולדים. חלקם היו תפקידים ברורים כגון mavs ו-trif (טיר-domain-מכיל מתאם אינטרפרון-β), בעוד אחרים היו קשורים לחסינות אף מנגנונים מורכבים יותר (למשל, histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. למידע היעד המאוחסן ברצף SSHHP יש את הפוטנציאל לזהות מסלולים בעלי אפקטים אנטי-ויראליות נגד וירוסים אלה. תגובות אנטי ויראליות ב vivo הם לעתים קרובות לוירוסים מסוימים26,43. לדוגמה, קבוצות מערכות של חלבונים לקצץ יש השפעות אנטי ויראליות על וירוסים שונים43,44,45, כמה הם גורמי הגבלה נגיפית (למשל, HIV ו TRIM5α). הספציפיות של חלבונים לקצץ (~ 70 זוהו) עדיין נבדק44,45. המידע בתוך SSHHPS עשוי לתרום להבנת האופן שבו וירוסים אלה להתחמק תגובות החיסונית מולדים. דפוסים אחרים וקשרי גומלין עלולים להיות נחשפים כמו SSHHPS יותר נבדקים.
הבדלים ספציפיים למינים התבררו בניתוח שלנו (איור 2, איור 10). וירוסים אלה ידועים להשפיע על מינים מסוימים יותר מאשר אחרים. מידע אודות טווח המארח, הרגישות המארחת וההגנות המארחות עשויים להופיע בתוך SSHHPS. לדוגמה, סוסים, המינים הרגישים ביותר לווירוסים דלקת קרום המוח של הסוסים, חסר באזור TRIM14 אנושי שנחתך ברובו על-ידי ה-VEEV nsP2 פרוטאז. בני אדם לעתים נדירות למות מזיהומים VEEV אבל יכול להיות נגוע24. חלבון TRIM14 האנושי נשא מחשוף nsP2 פרוטאז רצף6. הנוכחות של אתר המחשוף מראים כי בני אדם יש מנגנון הגנה נגד וירוסים אלה. ציפורים כבר חשבו להיות מאגרים פוטנציאליים של וירוסים אלה46. רצף SSHHP המקביל בחלבון TRIM14 מתרנגולות שונה מהרצפים שנמצאו בבני אדם ובמינים אחרים. הבדלים עדינים כמו אלה עשויים להפוך חלבון מארח היעד בלתי ניתן לביטול או מאפשר בקלות רבה יותר. אגירי ואח ‘16 הראה כי מוטציה בלתי מעשית חלבון מחרוזת הנגרמת רמות גבוהות יותר של ifn לאחר זיהום וירוס דנגה, כי עכברים באופן טבעי לשאת גרסה של סטינג כי הוא לא נחתך על ידי Ns2B3 פרוטאז דנגה. חלבון מורטין העוקץ לא נחתך על ידי ZIKV פרוטאז47. בניתוח SSHHPS שלנו, ראינו גם הבדלים של המחשוף ZIKV פרוטאז האתר כאשר השוונו את החלבונים האנושיים עם אלה של מכרסמים6 (איור 10ד). לשחזר את המינים ספציפיים מסוג החיידקים האנטי-חרדה של חלבונים מארחים עשוי להיות חשוב במודלים של חיות המשמשות לווירוסים Group IV. עיכוב של מחשוף חלבון מארח יש גם השלכות בנוגע לפיתוח של מעכבי הקבוצה IV פרוטאז. בפרסום הקודם שלנו, הראנו שאנחנו יכולים לעכב את TRIM14 המחשוף על ידי nsP2 פרוטאז של VEEV באמצעות CA074 מתיל אסתר6. תוצאה זו עולה כי מולקולה קטנה מעכבי של פרוטסים אלה עשויים להיות מסוגלים לווסת את התגובות החיסונית מולדים כי הם מסוגלים לדכא את הזיהום6,31.
וריאציה גנטית בתוך מינים יש גם את הפוטנציאל לייצר הבדלים במחשוף הפרוטחרדה. הבדלים עדינים בשימוש קודון יכול להשפיע על ריבוכמה משהה48. מאז כמה הקבוצה הרביעית הפרוטזיות נגיפי מוטבע קרום ER, הבדלים אלה הפסקות יכול להשפיע על המחשוף של היעד אם המחשוף מתרחשת שיתוף בצורה מבצעית. חלק מאתרי המחשוף שזיהינו היו ברצפי פפטיד אותות (למשל, SFRP1) בעוד שאחרים היו פנימיים.
ניתוח SSHHPS יכול להפיק מידע השונה משיטות אחרות של ניתוחי חלבון מארחים. הניתוח SSHHPS היה זול וקל להעסיק. השימוש במערכת ביטויים חיידקית מאפשר בדיקה של קטעים קצרים (~ 25 חומצות אמינו) של רצפי יונקים ללא שימוש בתרבות התא של היונקים. מצאנו כי מצעים CFP YFP היו מסוגלים לסבול את כל רצפי החלבונים האנושיים נבדק; עם זאת, תשואות מגוונות. ב assays דומה, מצעים המכילים את רצפי החלבון האנושי כל עוד 63 חומצות אמינו הביעו בהצלחה, מטוהרים, ומנוצל עבור ניתוחים קינטי ו מעכבי ההקרנה49,50,51. מאחר שרק כמויות קטנות של המצע נדרשות לצורך הצורך המתמשך, ניתן לחקור מספר רב של מטרות. אחד היתרונות של המערכת היא כי מצעים CFP/YFP ניתן להשתמש עבור SDS-דף ניתוחים ועבור ניתוחים קינטי מורכבים יותר (כלומר, IC50, ki, km, Vמקסימום). לגילוי סמים, תרכובות מעכבות יכולות לייצר פריטים בערוץ הפלורסנט. לפיכך, היכולת המתמדת בשילוב עם שיטת מתמשך מאפשרת לאדם לאשר מחשוף או עיכוב במחשוף. ניתן לקחת את הדגימות של שיטת ה-SDS-PAGE הרציפה ישירות מתוך הצלחות 96-היטב. CFP/YFP מצעים שימשו לסינון ספריה מורכבת52. עם זאת, ניתוחים נוספים נדרשים כדי לקבוע אם מצע מתאים להקרנה בתפוקה גבוהה כגון חישוב Z-factor53.
אתגר אחד בעיצוב מצע מזהה את האזור סביב הקשר scissile כי הוא מאוגד ומזוהה על ידי פרוטאז. בדוגמאות שמוצגות כאן, התחלנו עם 12 רצפי שאריות שהיו ממורכזים סביב הקשר הscissile. לאחר ניתוח של מערכים רצף של אתרי המחשוף הומולוגיה לשקעים N-טרמינל של איגרת החוב הscissile נמצא עבור פרוטאז VEEV, ואילו עבור פרוטאז ZIKV הומולוגיה לכמה שאריות C-terminal נמצאה. במודל סיליקו של המצע העוגן ניתן להשתמש כדי לעצב ניסויים מוטארזיס בבימויו של האתר החוקרים את האתרים המחייבים של המצע. מאז המצע ורצפי אנזימים הם על פלמידים, או יכול להיות מוטציה כדי לבדוק את המודלים סיליקו או מאתר המשנה טולרנסים. הדבר עשוי להיות יתרון אם מבנה גביש של המצע (ים) המאוגד אינו זמין.
ניתוח SSHHPS עשוי גם להניב מידע חדש על המנגנונים שבהם פנוטיפים המושרה על ידי וירוסים מיוצרים על ידי אנזימים ויראליים. אחד היעדים zikv, SFRP1, הוא חלק של wnt איתות מסלול ויש לו תפקידים הן במוח והן בפיתוח העין ואת התגובות החיסונית36,37,54,55,56,57. מצאנו כי רצפי החלבון האחרים שניתן לגזור על ידי ZIKV ns2B/ns3 פרוטאז היו גם חלבונים מעורבים המוח ופיתוח העין; חריגות בשניהם נצפו בתסמונת Zika מולדים נחשבים לחלק הווירוס המושרה פנוטיפ58.
ניתן לנצל את החיזוי של אינטראקציות מארח-פתוגן למגוון יישומים: טיפולים ויראליים ספציפיים למטרה; דה-סיכון חיסונים וירוס חיים; עידון, חיזוי או מבחר של דגמי בעלי חיים; חיזוי של שורה לטווח או רגישות; חיזוי אירועים zoonotic; וחיזוי ההגנות המארחות. מאחר שהשיטות המתוארות הן מבוססות רצף, הן עשויות להיות בעלי ערך שיכללו בעתיד.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי הסוכנות להפחתת איום הביטחון (DTRA) מספרי הפרויקט CB-SEED-SEED09-2-0061 ו CBCall4-CBM-05-2-0019, ובחלקו על ידי התוכנית הפנים/מחקר אקסטרקיר של NCATS, NIH (XH) ו מחקר הצי בסיס קרנות מעבדה.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |