שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית
Summary
פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.
Abstract
מפתח אירועים סלולריים כמו התמרה אותות וסחר בקרום להסתמך על מיקום החלבון הנכון בתוך תאים סלולריים. ובכך חשוב לענות על שאלות ביולוגיות רבות באופן מדויק. החיפוש אחר תווית איתנה לזיהוי לוקליזציה של חלבון בשילוב עם שימור הסלולר נאותה וכתמים כבר מאתגרת היסטורית. ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) הובילו לפיתוח שיטות ואסטרטגיות רבות כדי להגביר את שימור הסלולר והתווית היעד חלבונים. Peroxidase חדש יחסית מבוסס על תג גנטי, APEX2, הוא מנהיג מבטיח בתגים EM-אקטיב cloneable. הכנה לדוגמה עבור שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) יש גם מתקדם בשנים האחרונות עם הופעתו של קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (HPF) ו בטמפרטורות נמוכות התייבשות וכתמים באמצעות הקפאת החלפת (FS). Hpf ו-FS לספק שימור מעולה של מבנה האולטרסאונד הסלולרי עבור הדמיה TEM, השני רק ישיר-הדמיה ההקפאה של דגימות אינדקטור. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור שיטת ה-קריואיפקס, המשלבת את השימוש בתג APEX2 עם HPF ו-FS. בפרוטוקול זה, חלבון של עניין מתויג עם APEX2, ואחריו קיבעון כימי ואת התגובה peroxidase. במקום התייבשות כתמים ואלכוהול בטמפרטורת החדר, המדגם הוא קריוקבוע ועובר התייבשות וכתמים בטמפרטורה נמוכה באמצעות FS. באמצעות קריואיפקס, לא רק יכול להיות חלבון של עניין להיות מזוהה בתוך תאים subcellular, אבל גם מידע נוסף ניתן לפתור ביחס לטופולוגיה שלה בתוך קרום שנשמר מבחינה מבנית. אנו מראים כי שיטה זו יכולה לספק החלטה גבוהה מספיק כדי לפענח דפוסי הפצת חלבונים בתוך אורגל לומן, וכדי להבחין את מידור החלבון בתוך מאורגא אחד בסמיכות לאורגלים אחרים בלתי מסומנים. עוד, קריופיסגה היא תהליכים פשוטה וקלה לתאים גדל בתרבות הרקמה. היא אינה מאתגרת יותר מבחינה טכנית מאשר קריופיציה טיפוסית והקפאת שיטות החלפה. קריואיפקס היא ישימה באופן נרחב ניתוח TEM של כל חלבון ממברנה שניתן לתייג גנטית.
Introduction
מחקרים ביולוגיים כוללים לעתים קרובות שאלות לפתרון לוקליזציה של חלבון תת-תאי בתוך תאים ואורגלים. מיקרוסקופ immunofluorescence מספק תצוגה שימושית ברזולוציה נמוכה של לוקליזציה חלבון, וההתקדמות האחרונה בהדמיה סופר ברזולוציה דוחפים את גבולות הרזולוציה עבור מתויג פלואורוסקופים חלבונים1,2,3. עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) נשאר תקן זהב עבור דימות ברזולוציה גבוהה הסלולר מבנה הנייד, למרות תיוג של חלבונים הוא אתגר.
מבחינה היסטורית, מספר שיטות EM שימשו לגישה לשאלות של לוקליזציה של חלבון ultraקונסטרוקטיבי. אחת השיטות הנפוצות ביותר היא מיקרוסקופ חיסוני (IEM), כאשר נוגדנים ספציפיים אנטיגן משמשים כדי לזהות את חלבון הריבית. האות EM מופק על ידי יישום של נוגדנים משני מצועם חלקיקי אלקטרון-צפוף, בדרך כלל הזהב4,5. לחילופין, יש להשתמש בנוגדנים עם אנזימים כגון הסוס צנון peroxidase (hrp) יכול לשמש כדי לייצר מזרז אלקטרון צפוף6,7,8. שתי גישות עיקריות קיימות עבור IEM, כינה הטבעה מראש ושלאחר הטבעה של תוויות. ב-הטבעה מראש של IEM, נוגדנים מוצגים ישירות לתוך תאים, אשר מחייבת קיבוע אור וחדירות של התאים9,10,11. שני השלבים עלולים לגרוםנזק. למבנההאולטרסאונד 12,13 פיתוח של נוגדנים קטנים באופן משמעותי המורכב של נוגדן קטע Fab מצועעם 1.4 ננומטר ננוגולד מאפשר התנאים החדירות עדין מאוד לשמש; עם זאת, ננוגולד קטן מדי להדמיה ישירה תחת TEM ומחייב שלבי שיפור נוספים להפוך לגלויים14,15,16. ב-IEM שלאחר ההטבעה, נוגדנים מוחלים על חלקים דקים של תאים אשר עובדו באופן מלא על ידי קיבוע, התייבשות, והטבעה שרף17. בעוד שגישה זו נמנעת משלב החדירות, שמירה על אפירופה של ריבית לאורך ההכנה לדוגמא היא אתגר של18,19,20. שיטת טויאסו של קיבוע האור ולאחריה הקפאה, הקפאת ההקפאה וזיהוי הנוגדן מספקים שימור אפיפי משופר של21,22. עם זאת, הדרישות הטכניות של כריתת המיקרו-בדיקת ההקפאה, כמו גם הניגודיות התת-אופטימלית שהושגה בתא, הן חסרונות23.
השימוש בתגים מקודדים גנטית מבטל רבים של הקשיים של IEM הקשורים לזיהוי של חלבון הריבית. מגוון של תגים זמינים, כולל hrp, ferritin, reash, minisog, ו מטטידור24,25,26,27,28,29,30,31,32. לכל אחד מהם יש יתרונות על פני שיטות קודמות, אך לכל אחד מהם יש חסרונות המונעים שימוש נרחב. החסרונות הללו נע בין חוסר פעילות של HRP ב ציטוסול לגודל גדול של תג ferritin, רגישות קלה של ReAsH, וגודל קטן וחוסר תאימות עם כתמים סלולריים של מטטימיום. לאחרונה, חלבון נגזר ascorbate peroxidase כבר מהונדסים כמו תג EM, בשם APEX233,34. כמו peroxidase, APEX2 יכול לזרז את החמצון של 3, 3 ‘ diaminobenzidine (בתוך), הפקת מזרז כי מגיב עם אוסמיום tetroxide כדי לספק ניגודיות EM המקומי עם דיפוזיה מינימלית מן החלבון של עניין (פחות מ 25 ננומטר)33,35. שלא כמו שיטות מבוססות HRP מסורתיות, APEX2 הוא יציב מאוד ונשאר פעיל בכל התאים הסלולריים33. דגימות ניתן לעבד עבור TEM באמצעות כתמים מסורתיים לדוגמה EM ושיטות המאפשרות ויזואליזציה טובה של המבנים שמסביב33,34,36. בשל גודלו הקטן, יציבותו, ו רב-תכליתיות, APEX2 התפתחה כתגית EM עם פוטנציאל גדול.
רבים מהגישות שנדונו לעיל אינן יכולות להיות או עדיין לא בשילוב עם המצב הנוכחי של האמנות בשימור בדיקת אולטרה מבנית, קריוקטיביות והקפאה בטמפרטורות נמוכות. כך, הם סובלים מחוסר שימור ממברנה ו/או כתמים תא כדי לקבוע לוקליזציה חלבון מדויק. הדבר מגביל בהכרח את הרזולוציה והפרשנות של הנתונים שניתן להשיג. קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (hpf) כרוכה הקפאה מהירה של דגימות בחנקן נוזלי בלחץ גבוה (~ 2,100 bar), הגורם ויטריפיקציה ולא התגבשות של דגימות מימית, ובכך שמירה על תאים במצב קרוב-יליד37,38,39. Hpf אחריו הקפאת החלפת (FS), טמפרטורה נמוכה (-90 ° c) התייבשות אצטון בשילוב עם דגירה עם כתמי EM אופייני כגון אוסמיום tetroxide ו uranyl אצטט. HPF ו-FS יחד לספק יתרון ברור על גבי קיבעון כימי מסורתי (תהליך ארוך יותר אשר יכול להוביל חפצי אמנות) התייבשות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח (אשר יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים), ולכן רצוי לשלב עם תגי EM הטוב ביותר עבור זיהוי חלבון.
אחת הסיבות כי HPF/FS לא בשילוב עם תיוג APEX2 היא כי קיבעון כימי קל הוא תנאי מוקדם עבור התגובה peroxidase, הגבלת הדיפוזיה של המוצר התגובה מחיר. במחקרים APEX2 עד כה, קיבעון והתגובה peroxidase הם ואחריו שיטות EM מסורתיות לצביעת ואלכוהול התייבשות33,36. עם זאת, זה הוכח כי בעקבות קיבעון כימי עם HPF/FS מספק יתרון ברור בשימור על קיבעון כימי מסורתי התייבשות אלכוהול לבד40. הפסד של שלמות ultraקונסטרוקטיבית לראות בדוגמאות TEM מסורתיות נראה פחות מחובר קיבעון מאשר התייבשות, אשר נעשה בדרך כלל באמצעות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח, והוא יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים40,41. כדי לפתח את שיטת קריואיפקס, שיערו כי הקיבעון הכימי ואת התגובה peroxidase, ואחריו HPF ו-FS, היה לייצר תוצאה אופטימלית מבחינת שימור ultraקונסטרוקטיבי.
כאן אנו מציגים את פרוטוקול קריואיפקס, המשלב APEX2 תיוג עם קריוקיבוע והקפאת שיטות החלפת (איור 1). פרוטוקול פשוט זה מורכב מגלגול של חלבון APEX2 מתויג של עניין, קיבעון כימי של תאים, ואת התגובה peroxidase. HPF ו-FS מבוצעים לאחר מכן על ידי שתילת שרף אופייני והדקים. הדמיה TEM מגלה שימור מעולה של ultrastructure בנה באמצעות שיטה זו. בנוסף, לוקליזציה ברזולוציה גבוהה subcellular והפצה מרחבית של רשתית העין (ER) לומפלמיק חלבון נצפו. שיטה זו שימושית רבות לאיתור לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני. בידינו, השיטה עבדה בהצלחה עבור מגוון של קווי תאים שגדלו בתרבית רקמות, כולל HEK-293T (כליה עובריים האדם), הלה (סרטן צוואר הרחם האנושי), Cos7 (אפריקה ירוק כליות הקוף פיברוהפיצוץ), ו BHK (כליה אוגר התינוק). הוראות מפורטות מתוארות להלן באמצעות התאים HEK-293T.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול קריואיפקס המוצג כאן מספק שיטה איתנה לאפיון הלוקליזציה של חלבונים ממברנות בתוך הסביבה התאית. לא רק שימוש של תג APEX2 מקודד גנטית לספק לוקליזציה מדויק של חלבון של עניין, אבל השימוש קריוקיבעון בטמפרטורות נמוכות מספק שימור מעולה וכתמים של מבנה האולטרה הסלולרי המקיף. בשילוב, גישות אלה ה…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרוטוקול המתואר כאן נובע מפרסום על ידי Sengupta ואח ‘, היומן של מדע התא, 132 (6), jcs222315 (2019)48. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים R01GM10092 (כדי ס) ו AI081077 (R.V.S.) מן המכון הלאומי לבריאות, CTSI-106564 (ל ס) מתוך אינדיאנה מכון למדעי המחקר, ו PI4D-209263 (כדי ס) מהמכון האוניברסיטאי Purdue לדלקת, אימונולוגיה, ומחלות זיהומיות.
Materials
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637-1G | |
| Acetone (Glass Distilled) | Electron Microscopy Sciences | 10016 | |
| Beakers; Plastic, Disposable 120 cc | Electron Microscopy Sciences | 60952 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| Cryogenic Storage Vials, 2 mL | VWR | 82050-168 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin | Sigma-Aldrich | 44611-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 | Sigma-Aldrich | 44612-500ML | |
| Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) | Sigma-Aldrich | 44613-100ML | |
| Durcupan ACM Fluka,single component D | Sigma-Aldrich | 44614-100ML | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
| Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement | Corning | 355104 | |
| Glass Knife Boats, 6.4 mm | Electron Microscopy Sciences | 71008 | |
| Glass Knifemaker | Leica Microsystems | EM KMR3 | |
| Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| HEK 293 Cells | ATCC | CRL-1573 | |
| High Pressure Freezer with Rapid Transfer System | Leica Microsystems | EM PACT2 | Archived Product Replaced by Leica EM ICE |
| Hydrogen Peroxide 30% Solution | Fisher Scientific | 50-266-27 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000015 | |
| Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm | Mager Scientific | 16707898 | |
| Osmium Tetroxide, crystalline | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade | VWR | 97062-950 | |
| Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm | Mager Scientific | 16702738 | |
| Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film | Electron Microscopy Sciences | FF2010-Cu | |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 102090-962 | |
| Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) | Avantor Macron Fine Chemicals | 7708-10 | |
| Tannic Acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 | |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm | VWR | 25382-166 | |
| Ultra Glass Knife Strips | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | EM UC7 | |
| Uranyl Acetate Dihydrate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
Referenzen
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
- De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
- Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
- Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
- Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
- Oliver, C., Oliver, C., Jamur, M. C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 381-386 (2010).
- Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
- Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A., Mueller-Reichert, T., Verkade, P. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. 111, 21-35 (2012).
- Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
- Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
- Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
- Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
- Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
- Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
- Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
- Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
- Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
- Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
- Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E., Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
- Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. L., Hajibagheri, N. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. 117, 77-97 (1999).
- Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
- Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
- Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
- Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
- Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) – mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
- Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
- Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX – an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
- Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
- Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
- McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
- Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
- Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
- Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
- Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
- Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , (2019).
- Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).
