זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות לפסאודומונס syringae pv. עגבניה בעגבניה באמצעות שתיל שיטפון שיטת
Summary
השטף שתיל המבול מאפשר הקרנה מהירה של הקלה עגבניות בר עבור התנגדות פסבדו החיידק syringae bacterium. מעשה זה, המשמש בשילוב עם השימוש בקביעת הצמיחה החיידקית של הנבט, יכול לסייע עוד יותר באפיון ההתנגדות הבסיסית לחיידק, וניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הבסיס לאוכלוסיות מיפוי כדי לברר את היסוד הגנטי של ההתנגדות.
Abstract
עגבנייה היא יבול חשוב agronomically שיכול להיות נגוע על ידי פסאודומונס syringae, חיידק גראם שלילי, וכתוצאה מכך מחלת הגרגר חיידקי. העגבנייה-P. syringae pv. מערכת העגבניות היא בשימוש נרחב כדי לנתח את הבסיס הגנטי של הצמח תגובות מולדים התנגדות המחלה. בעוד המחלה הצליחה בהצלחה במשך עשרות שנים רבות באמצעות המבוא של pto/Prf האשכול גנים מסולנום פיפינליות לתוך עגבניה מעובד, גזע 1 זנים של P. syringae התפתחו כדי להתגבר על התנגדות הענקת ידי pto/prf האשכול גנים ומתרחשים ברחבי העולם.
מינים עגבניות בר הם מאגרים חשובים של גיוון טבעי בזיהוי הפתוגן, כי הם התפתחו בסביבות מגוונות עם לחצים הפתוגן שונים. במסכים טיפוסיים עבור עמידות למחלות בעגבניות בר, צמחים למבוגרים משמשים, אשר יכול להגביל את מספר הצמחים שניתן לוקרן בשל זמן צמיחה המורחבת שלהם ודרישות שטח גדילה גדול יותר. פיתחנו שיטה למסך 10-יום-שתילי עגבניות של התנגדות, אשר ממזער את הצמיחה הצמח זמן וחלל קאמרית הצמיחה, מאפשר תחלופת מהירה של צמחים, ומאפשר לדגום גדלים גדולים להיבדק. שתילים התוצאות של הישרדות או מוות יכול להיות מטופלים כמו פנוטיפים דיסקרטית או על סולם ההתנגדות המוגדר על ידי כמות הצמיחה החדשה בשתילים ששרדו לאחר ההצפה. שיטה זו כבר ממוטבת למסך 10-יום-שתילי עגבניות התנגדות לשני זני p. syringae והוא יכול בקלות להתאים זנים p syringae אחרים.
Introduction
פסאודומונס syringae הוא חיידק פתוגניים שלילי גרם מדביק מגוון רחב של מארחי הצמח. חיידקים להיכנס למפעל מארח דרך הסטוטה או פצעים פיזיים מתרבים בתוך האפוסט1. צמחים התפתחו תגובה חיסונית דו שכבתית כדי להגן מפני זיהום על ידי פתוגנים חיידקיים. הרמה הראשונה מתרחשת במשטח התא של הצמח, שבו קולטני הזיהוי תבניות על קרום התא הצמח תופס מאוד שימור הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרי (PAMPs) בתהליך שנקרא PAMPS-מופעל חסינות (PAMPS)2. במהלך תהליך זה, המפעל המארח upregulates תגובת ההגנה מסלולים, כולל התצהיר של callose לקיר התא, סגירת שיניים, ייצור של מינים חמצן תגובתי, ו אינדוקציה של הגנים הקשורים בפתוגנזה.
חיידקים יכולים להתגבר על PTI על ידי ניצול סוג III הפרשה מערכת כדי לספק חלבונים, הנקראים מפלעריקים, ישירות לתא הצמח3. אפקטור חלבונים בדרך כלל המטרה מרכיבים של PTI ולקדם התקפה אלימה הפתוגן4. הרמה השנייה של חסינות הצמח מתרחשת בתוך תא הצמח על ידי הכרה של חלבונים האפקטור. הכרה זו תלויה גנים התנגדות, אשר לקודד נוקלאוטיד האתר מחייב לוקמיה עשיר לחזור המכיל קולטנים (NLRs). מסוגלים לזהות את העריקים ישירות או לזהות את פעילותם במטרה של התקפה אלימה או דמה5. לאחר מכן הם מפעילים תגובה חיסונית משנית בתהליך שנקרא אפקטור החיסון המופעל (אתי), אשר קשורה לעתים קרובות עם תגובה רגישות יתר (HR), צורה של מוות תאים מקומי באתר של זיהום6. לעומת התנגדות גנטית לגנים הקשורים אתי, הצמחים יכולים להפגין עמידות חלקית כמותית, אשר תלויה בתרומה של גנים מרובים7.
P. syringae pv. עגבניות (Pst) הוא סוכן סיבתי של גרגר חיידקי על עגבניות והוא בעיה חקלאית מתמשך. זנים השולט בשדה יש בדרך כלל מרוץ Pst 0 זנים המבטאים או שניהם מסוג III AvrPto ו AvrPtoB. DC3000 (PstDC3000) הוא גזע נציג 0 זן מודל פתוגן שיכול לגרום לגרגר חיידקי בעגבניה. כדי להילחם במחלת הגרגר החיידקי, המגדלים המאכבו את pto [P. syringae pv. עגבניה]/prf [pto התנגדות ו fenthion רגישות] שאשכול גנים מתוך מינים עגבניות פראי solanum פיפינאליןלזנים מודרניים8,9. הגן pto מקודד את החלבון סרין טראונין קינאז כי, יחד עם prf nlr, מעניקה עמידות ל PstDC3000 דרך ההכרה של העריקים AvrPto ו AvrPtoB10,11,12,13,14. עם זאת, התנגדות זו אינה יעילה נגד גזע המתעוררים 1 זנים, המאפשר התפשטות מהירה ואגרסיבית שלהם בשנים האחרונות15,16. גזע 1 זנים להתחמק הכרה על ידי האשכול pto/prf , כי AvrPto הוא איבד או מוטציה בזנים אלה, ו AvrPtoB מופיע לצבור מינימלית15,17,18.
אוכלוסיות עגבניות בר הם מאגרים חשובים של וריאציה טבעית עבור Pst התנגדות ובעבר שימשו כדי לזהות התנגדות פוטנציאל הרוח19,20,21. עם זאת, מסכי הנוכחי עבור עמידות הפתוגן לנצל 4 – 5-שבוע-צמחים למבוגרים בן20,21. לפיכך, הם מוגבלים בזמן הגדילה, בחלל חדר הצמיחה ובמידות קטנות יחסית. כדי להתמודד עם מגבלות של גישות קונבנציונליות, פיתחנו syringae בקצב גבוה של עגבניות P. שיטת התנגדות באמצעות שתילי עגבניות בן 10 ימים22. גישה זו מציעה מספר יתרונות על-ידי שימוש בצמחי מבוגרים: כלומר, זמן צמיחה קצר יותר, דרישות שטח מופחת ותפוקה גבוהה יותר. יתר על כן, הדגמנו כי גישה זו בנאמנות לכידה התנגדות המחלה פנוטיפים שנצפו בצמחים למבוגרים22.
בתיקון המבול שתיל המתואר בפרוטוקול זה, שתילי עגבניות גדלים על מנות פטרי של מדיה מורראשיג ו Skoog (MS) סטרילי במשך 10 ימים ולאחר מכן מוצפים באינת המכיל את החיידקים של הריבית ואת החומרים. בעקבות ההצפה, השתילים ניתן להעריך ככמת עבור התנגדות למחלות באמצעות assays הגידול חיידקי. בנוסף, שתיל הישרדות או מוות יכול לשמש התנגדות דיסקרטית או פנוטיפ המחלה 7 – 14 ימים לאחר ההצפה. גישה זו מציעה חלופה בתפוקה גבוהה עבור הקרנת מספר גדול של הגשת עגבניות בר עבור התנגדות pst מרוץ 1 זנים, כגון Pst להתאמץ t1 (pstt1), והוא יכול בקלות להיות מותאם לזנים חיידקיים אחרים של עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול עבור המבול החיסון עם pstDC3000 או pstT1 אופטימיזציה כדי לזהות עמידות אלה זנים חיידקיים בשתילים עגבניות מתוארת. ישנם מספר פרמטרים קריטיים לקבלת תוצאות מיטביות של התנגדות שתיל, כולל ריכוז חיידקי וריכוז החומרים, אשר נקבעו באמצעות מדעית22. עבור PstDC3000, הצפיפות האו?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג Calma על בדיקת ההשפעה של עוצמת המדיה על המחלה או תוצאות ההתנגדות. אנו מודים לד ר מייסר באודין וד ר קרל שייבר ממעבדת לואיס למתן הערות והצעות בונות על כתב היד. מחקר על חסינות הצמח במעבדה לואיס היה נתמך על ידי משרד החקלאות בשנת 2030-21000-046-00D ו-2030-21000-050-00D (JDL), ואת מינהל NSF למדעי הביולוגיה IOS-1557661 (JDL).
Materials
| 3M Tape Micropore 1/2" x 10 YD CS 240 (1.25 cm x 9.1 m) | VWR International | 56222-182 | |
| 3mm borosilicate glass beads | Friedrich & Dimmock | GB3000B | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Biophotometer Plus | Eppendorf | E952000006 | |
| Biosafety cabinet, class II type A2 | |||
| BRAND Disposable Plastic Cuvettes, Polystyrene | VWR International | 47744-642 | |
| Chenille Kraft Flat Wood Toothpicks | VWR International | 500029-808 | |
| cycloheximide | Research Products International | C81040-5.0 | |
| Dibasic potassium phosphate anhydrous, ACS grade | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Dimethylformamide | |||
| Dissecting microscope (Magnification of at least 10x) | |||
| Ethanol – 190 Proof | |||
| Falcon polystyrene 96 well microplates, flat-bottom | Fisher Scientific | 08-772-3 | |
| Glass Alcohol Burner Wick | Fisher Scientific | S41898A / No. W-125 | |
| Glass Alcohol Burners | Fisher Scientific | S41898 / No. BO125 | |
| Glycerol ACS reagent | VWR International | EMGX0185-5 | |
| Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Magnesium chloride, ACS grade | VWR International | 97061-356 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, ACS grade | VWR International | 97062-130 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | |||
| Microcentrifuge tubes, 2.2 mL | |||
| Mini Beadbeater-96, 115 volt | Bio Spec Products Inc. | 1001 | |
| Murashige & Skoog, Basal Salts | Caisson Laboratories, Inc. | MSP01-50LT | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 20-200uL | Rainin | L8-200XLS | |
| Pipet-Lite XLS LTS 8-CH Pipet 2-20uL | Rainin | L8-20XLS | |
| Polystyrene 100mm x 25mm sterile petri dish | VWR International | 89107-632 | |
| Polystyrene 150mm x 15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | FB08-757-14 | |
| Polystyrene 150x15mm sterile petri dish | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Pure Bright Germicidal Ultra Bleach 5.7% Available Chlorine (defined as 100% bleach) | Staples | 1013131 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology | R-120-25 | |
| Silwet L-77 (non-ionic organosilicone surfactant co-polymer C13H34O4Si3 surfactant) | Fisher Scientific | NCO138454 | |
| Tips LTS 20 μL 960/10 GPS-L10 | Rainin | 17005091 | |
| Tips LTS 250 μL 960/10 GPS-L250 | Rainin | 17005093 | |
| VWR dissecting forceps fine tip, 4.5" | VWR International | 82027-386 |
Referenzen
- Underwood, W., Melotto, M., He, S. Y. Role of plant stomata in bacterial invasion. Cell Microbiology. 9 (7), 1621-1629 (2007).
- Zipfel, C. Early molecular events in PAMP-triggered immunity. Current Opinion in Plant Biology. 12 (4), 414-420 (2009).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Lewis, J. D., Desveaux, D., Guttman, D. S. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Schreiber, K. J., Baudin, M., Hassan, J. A., Lewis, J. D. Die another day: molecular mechanisms of effector-triggered immunity elicited by type III secreted effector proteins. Seminars in Cell and Developmental Biology. 56, 124-133 (2016).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Molecular Biology. 44 (3), 321-334 (2000).
- Boyd, L. A., Ridout, C., O’Sullivan, D. M., Leach, J. E., Leung, H. Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture. Trends in Genetics. 29 (4), 233-240 (2013).
- Pitblado, R. E., MacNeill, B. H. Genetic basis of resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato in field tomatoes. Canadian Journal of Plant Pathology. 5 (4), 251-255 (1983).
- Pedley, K. F., Martin, G. B. Molecular basis of Pto-mediated resistance to bacterial speck disease in tomato. Annual Reviews of Phytopathology. 41, 215-243 (2003).
- Ronald, P. C., Salmeron, J. M., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. The cloned avirulence gene AvrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pto resistance gene. Journal of Bacteriology. 174 (5), 1604-1611 (1992).
- Martin, G. B., et al. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science. 262 (5138), 1432-1436 (1993).
- Salmeron, J. M., Barker, S. J., Carland, F. M., Mehta, A. Y., Staskawicz, B. J. Tomato mutants altered in bacterial disease resistance provide evidence for a new locus controlling pathogen recognition. Plant Cell. 6 (4), 511-520 (1994).
- Salmeron, J. M., et al. Tomato Prf is a member of the leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes and lies embedded within the Pto kinase gene cluster. Cell. 86 (1), 123-133 (1996).
- Scofield, S. R., et al. Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science. 274 (5295), 2063-2065 (1996).
- Kunkeaw, S., Tan, S., Coaker, G. Molecular and evolutionary analyses of Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (4), 415-424 (2010).
- Cai, R., et al. The plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato is genetically monomorphic and under strong selection to evade tomato immunity. PLoS Pathogens. 7 (8), 1002130 (2011).
- Almeida, N. F., et al. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Molecular Plant-Microbe Interactions. 22 (1), 52-62 (2009).
- Lin, N. C., Abramovitch, R. B., Kim, Y. J., Martin, G. B. Diverse AvrPtoB homologs from several Pseudomonas syringae pathovars elicit Pto-dependent resistance and have similar virulence activities. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 702-712 (2006).
- Rose, L. E., Langley, C. H., Bernal, A. J., Michelmore, R. W. Natural variation in the Pto pathogen resistance gene within species of wild tomato (Lycopersicon). I. Functional analysis of Pto alleles. Genetik. 171 (1), 345-357 (2005).
- Thapa, S. P., Miyao, E. M., Davis, R. M., Coaker, G. Identification of QTLs controlling resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1 strains from the wild tomato Solanum habrochaites LA1777. Theoretical and Applied Genetics. 128 (4), 681-692 (2015).
- Bao, Z. L., et al. Identification of a candidate gene in Solanum habrochaites for resistance to a race 1 strain of Pseudomonas syringae pv. tomato. Plant Genome. 8 (3), 1-15 (2015).
- Hassan, J. A., Zhou, Y. J., Lewis, J. D. A rapid seedling resistance assay identifies wild tomato lines that are resistant to Pseudomonas syringae pv. tomato race 1. Molecular Plant-Microbe Interactions. 30 (9), 701-709 (2017).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 44 (2), 301-307 (1954).
- Uppalapati, S. R., et al. Pathogenicity of Pseudomonas syringae pv. tomato on tomato seedlings: phenotypic and gene expression analyses of the virulence function of coronatine. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (4), 383-395 (2008).
- Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).
- Lu, H., McClung, C. R., Zhang, C. Tick tock: circadian regulation of plant innate immunity. Annual Review of Phytopathology. 55, 287-311 (2017).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Nature. 470 (7332), 110-114 (2011).
